冷鮮灘羊肉貯藏中菌體蛋白質(zhì)與微生物群落演替的關(guān)聯(lián)性分析

趙曉策，胡倩倩，羅瑞明*，張赫宇

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

動(dòng)物被宰后，活體的生長(zhǎng)代謝也同時(shí)停止，但由于機(jī)體呼吸與血液循環(huán)中斷，肌細(xì)胞內(nèi)的各種需氧性生化反應(yīng)停止，代謝與活體產(chǎn)生差異。冷鮮肉在貯藏過(guò)程中，貯藏溫度一直控制在0～4 ℃，能抑制表面大部分的嗜溫菌與致病菌的生長(zhǎng)，而對(duì)嗜冷細(xì)菌的影響并不明顯[1]，所以冷鮮肉依舊會(huì)被外源性微生物污染，導(dǎo)致肉品腐敗變質(zhì)[2]，使得環(huán)境中的菌落總數(shù)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮值隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的種類(lèi)和含量也發(fā)生變化[3]，而微生物生長(zhǎng)繁殖因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的不同開(kāi)始相互競(jìng)爭(zhēng)，最后能適應(yīng)一切不利的生長(zhǎng)環(huán)境，且對(duì)肉品變質(zhì)發(fā)揮主要作用的微生物只有一小部分[4-6]。藍(lán)蔚青等[7]及劉朏[8]在研究冷卻肉時(shí)，均檢驗(yàn)出其在貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌、氣單胞菌屬，然而若初始菌相中存在葡萄球菌，它會(huì)逐步躍升為優(yōu)勢(shì)菌。其中假單胞菌成為肉品腐敗優(yōu)勢(shì)菌的原因主要是：假單胞菌可以利用肉品在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖，從而使假單胞菌的滋生能力優(yōu)于其他競(jìng)爭(zhēng)性菌群。Gill等[9]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌的生長(zhǎng)速率和數(shù)目與其他細(xì)菌相互作用關(guān)系不顯著。于見(jiàn)亮[10]發(fā)現(xiàn)假單胞菌的含量最高，幾乎達(dá)到了菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值；并隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，數(shù)目不停上升，一直是優(yōu)勢(shì)菌。而宏基因組學(xué)[11]作為一種新的微生物研究方法，逐漸代替了變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性等技術(shù)，為全面認(rèn)識(shí)其群落水平上的生態(tài)學(xué)意義和功能創(chuàng)造新的路徑。深入探究這些優(yōu)勢(shì)菌的種類(lèi)、生長(zhǎng)狀態(tài)及代謝過(guò)程，在解決肉類(lèi)腐敗變質(zhì)問(wèn)題時(shí)可做到對(duì)癥下藥[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)以貯藏過(guò)程中的冷鮮灘羊肉為研究對(duì)象，采用組合蛋白芯片與表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-f l ight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）平臺(tái)對(duì)冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中的微生物蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，找出與其有關(guān)聯(lián)的19 個(gè)菌體蛋白質(zhì)，并結(jié)合宏基因組測(cè)序的方法[3]分析細(xì)菌多樣性，找出貯藏時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌。使用主成分分析（principal components analysis，PCA）及熱力圖分析研究微生物差異蛋白質(zhì)與菌落演替的關(guān)聯(lián)性，找出優(yōu)勢(shì)菌與微生物菌體蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，對(duì)冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中微生物調(diào)控及其微生物群落演替驅(qū)動(dòng)機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮灘羊后腿肉，購(gòu)自于寧夏大夏牧場(chǎng)食品有限公司（灘羊飼養(yǎng)期間不做任何生物性防疫工作，且定期進(jìn)行清糞、消毒處理），當(dāng)天屠宰后立刻放入冷藏箱，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后迅速放入-20 ℃冰箱1 h，使其中心溫度降至0 ℃，托盤(pán)密封包裝后將其取出置于0 ℃冰箱貯藏。

核糖核酸酶A、溶菌酶、S緩沖液、DV-A緩沖液、W2濃縮緩沖液、洗脫劑（均為分析純） 上海百賽生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、甘油、異丙醇、異丁醇（均為分析純） 銀川泰豐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall Legend Micro 17型常溫離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；vortex-genie2 G-560E型旋渦混合儀 美國(guó)SI公司；SPECTRAMAX PLUS384型酶標(biāo)儀 美國(guó)MD公司；移液器 德國(guó)Eppendrop公司；JT-C型均質(zhì)器漯河市金田試驗(yàn)設(shè)備研究所；ZHWY-1102C型搖床中國(guó)智誠(chéng)公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

無(wú)菌條件下，將灘羊后腿肉分割成大小相等的5 塊，保鮮膜密封包裝，放在0 ℃冰箱，采集貯藏0、4、8 d灘羊肉表面刮擦物150 mg，表面刮擦物含微生物、血液、肉汁液等[1]，每組樣本做5 個(gè)平行。

1.3.2 冷鮮灘羊肉微生物菌體差異蛋白質(zhì)的獲取

胡倩倩等[14]采用組合蛋白芯片與SELDI-TOF-MS平臺(tái)對(duì)0、4、8 d的冷鮮灘羊肉表面微生物菌體蛋白質(zhì)進(jìn)行了分類(lèi)總結(jié)，本研究采用同樣的方法分析菌體蛋白質(zhì)在貯藏過(guò)程中的變化規(guī)律。

1.3.3 宏基因組測(cè)序法分析冷鮮灘羊肉微生物群落演替過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌

張赫宇[3]通過(guò)宏基因組技術(shù)對(duì)冷鮮灘羊肉中0、4、8 d微生物進(jìn)行DNA提取→16S rDNA PCR擴(kuò)增→Illumina MiSeq測(cè)序的統(tǒng)計(jì)分析，得到了灘羊肉中表面腐敗菌隨貯藏時(shí)間變化而顯示出的群落組成、豐度結(jié)構(gòu)以及多樣性。本研究采用同樣的方法通過(guò)對(duì)菌群組成分析，剔除變異系數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值）大于15%的樣品[15]，研究灘羊肉貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌及其變化規(guī)律。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017對(duì)冷鮮貯藏期為0、4、8 d灘羊肉的優(yōu)勢(shì)菌和菌體差異蛋白質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行總結(jié)分析。利用R軟件的Pearson算法和SIMCA軟件（V14.1, MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden）對(duì)隨貯藏時(shí)間變化的菌體蛋白質(zhì)峰面積平均值和表面主要腐敗優(yōu)勢(shì)菌菌數(shù)量進(jìn)行熱力圖分析和PCA，研究冷鮮灘羊肉表面微生物差異蛋白質(zhì)與微生物群落變化的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮灘羊肉宏基因組分析確定優(yōu)勢(shì)菌及其變化規(guī)律

圖1 冷鮮灘羊肉貯藏中的細(xì)菌群落分布圖Fig. 1 Distribution of bacterial communities in fresh and chilled Tan sheep meat

從圖1可知，第0天時(shí)，假單胞菌（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌（A c i n e t o b a c t e r）、微小桿菌（Exiguobacterium）、氣微菌（Aeromicrobium）、葡萄球菌（Staphylococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）等占大部分，其中假單胞菌為9.98%，不動(dòng)桿菌為19.15%，微小桿菌為6.18%，氣微菌為9.84%，成為冷鮮灘羊肉貯藏第0天的優(yōu)勢(shì)菌。這與周琰冰等[16]采用DGGE技術(shù)對(duì)0 ℃托盤(pán)包裝的冷鮮羊肉菌相分析，得出假單胞菌、芽孢桿菌和不動(dòng)桿菌屬在冷鮮羊肉貯藏初期為優(yōu)勢(shì)菌研究結(jié)果基本一致。與劉瑩瑩等[17]采用傳統(tǒng)方法對(duì)冷卻羊肉的初始菌相探究，得出致腐菌為假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌、葡萄球菌的研究結(jié)果一致。

冷鮮灘羊肉樣品貯存4 d時(shí)，假單胞菌、熱死環(huán)絲菌（Brochothrix）、埃希氏菌（Escherichia）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、梭菌（Clostridium）等占據(jù)優(yōu)勢(shì)。其中假單胞菌迅速增長(zhǎng)，從最初的9.98%增長(zhǎng)到20.06%，并成為此時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌。熱死環(huán)絲菌為12.43%，埃希氏菌為10.62%，梭菌為7.31%、乳酸桿菌為6.01%，成為冷鮮灘羊肉貯藏第4天的優(yōu)勢(shì)菌。第8天優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)含量分別為假單胞菌33.70%、熱死環(huán)絲菌23.98%、埃希氏菌11.40%、乳酸桿菌7.54%。

假單胞菌到第8天時(shí)成為主要優(yōu)勢(shì)菌，這是由于假單胞菌是一種需氧桿菌，冷藏條件下快速生長(zhǎng)。托盤(pán)包裝下的假單胞菌首先將葡萄糖作為生長(zhǎng)基質(zhì)，當(dāng)葡萄糖含量較低無(wú)法支撐其反應(yīng)，則將氨基酸作為生長(zhǎng)基質(zhì)，產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物[18]。假單胞菌是貯藏第8天時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌，也是灘羊肉貯藏過(guò)程中主要腐敗菌。這與國(guó)內(nèi)外對(duì)冷鮮羊肉中菌相變化研究一致。諸永志等[19]研究發(fā)現(xiàn)托盤(pán)包裝冷鮮羊肉中假單胞菌在貯藏第8天時(shí)比例為72.86%。熱死環(huán)絲菌雖然在貯藏初期占有的比例不大，但是迅速增長(zhǎng)，到第8天時(shí)占總數(shù)的23.98%。由于熱死環(huán)絲菌是一種兼性厭氧微生物，托盤(pán)包裝冷藏下熱死環(huán)絲菌利用葡萄糖作為基質(zhì)，將其分解為乙酸和已偶姻，同時(shí)還可以將亮氨酸和纈氨酸分解變成異戊酸和異丁酸。傅鵬等[20]對(duì)托盤(pán)包裝冷卻豬肉的探究中同樣得出，熱死環(huán)絲菌在初始菌相中所占的數(shù)量不多，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增長(zhǎng)的結(jié)果。

通過(guò)對(duì)冷鮮灘羊肉微生物多樣性的研究結(jié)果顯示，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物菌落總數(shù)呈明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)，前8 d增長(zhǎng)趨勢(shì)平穩(wěn)，到第8天菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值到達(dá)106CFU/g，之后菌落總數(shù)快速增大，超過(guò)106CFU/g[21-22]，說(shuō)明此時(shí)的冷鮮灘羊肉腐敗變質(zhì)，8 d后的冷鮮灘羊肉不存在微生物含量檢測(cè)意義。而在有效貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌有假單胞菌、熱死環(huán)絲菌、埃希氏菌和乳酸桿菌等。

2.2 冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中菌體蛋白質(zhì)的變化規(guī)律

圖2 冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中菌體差異蛋白變化規(guī)律Fig. 2 Changes in differential bacterial proteins from fresh Tan sheep meat during chilled storage

如圖2所示，共12 個(gè)菌體蛋白質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的變化而明顯上升或下降，且變化幅度較大。其中壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長(zhǎng)抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質(zhì)類(lèi)（M9074-86）、角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質(zhì)C-II（M8136-55）隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其所占比例有大幅度上升；與此同時(shí)，角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)3-1（M10359-3）、GRF/GHRH 生長(zhǎng)激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質(zhì)（M7709-26）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3）隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其所占比例有在下降，表明在貯藏過(guò)程中這部分菌體蛋白質(zhì)和微生物生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。

2.3 冷鮮灘羊肉菌體差異蛋白質(zhì)與微生物群落演替的關(guān)聯(lián)性分析

將12 個(gè)菌體蛋白質(zhì)與宏基因組測(cè)序得到的優(yōu)勢(shì)菌假單胞菌、熱死環(huán)絲菌、埃希氏菌和乳酸桿菌進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

2.3.1 PCA

利用SIMCA軟件對(duì)不同菌群及差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換加中心化格式化處理，然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析[23-25]。PCA模型的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)“PCA模型參數(shù)”：選取SIMCA軟件建模的模型編號(hào)M01；SIMCA的模型類(lèi)型PCA-X；模型的主成分2 個(gè)，分別表示差異蛋白質(zhì)和菌群；模型的觀測(cè)個(gè)數(shù)23 個(gè)，包括篩選出的19 個(gè)差異蛋白質(zhì)和4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌；R2X(cum)為0.918，代表模型對(duì)X變量（差異蛋白質(zhì)）的解釋性；R2Y(cum)為0.875，代表模型對(duì)Y變量（優(yōu)勢(shì)菌）的解釋性[26-28]。

圖3 差異蛋白質(zhì)-優(yōu)勢(shì)菌的PCA得分散點(diǎn)圖Fig. 3 PCA score scatter plot for differential proteomics and dominant bacteria

從圖3可得，假單胞菌、熱死環(huán)絲菌與差異蛋白質(zhì)壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長(zhǎng)抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質(zhì)類(lèi)（M9074-86）聚類(lèi)效果明顯，且呈正相關(guān)，與角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)3-1（M10359-3）呈負(fù)相關(guān)；埃希氏菌、乳酸桿菌與角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質(zhì)C-II（M8136-55）聚類(lèi)效果明顯，且呈正相關(guān)，與GRF/GHRH 生長(zhǎng)激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質(zhì)（M7709-26）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3）呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明這幾種蛋白質(zhì)與相關(guān)微生物相互聯(lián)系、影響的程度較大。

2.3.2 熱力圖分析

為對(duì)PCA得分散點(diǎn)圖進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，利用R軟件的Pearson算法進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算[29]，得到的相關(guān)性系數(shù)（corr）矩陣分析結(jié)果和相關(guān)性P值矩陣分析結(jié)果繪制為熱力圖，以展示相關(guān)性分析結(jié)果（圖4）。

圖4 優(yōu)勢(shì)菌-差異蛋白質(zhì)相關(guān)性熱力圖Fig. 4 Correlation heat map between dominant bacteria and differential proteomics

由圖4可知，壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長(zhǎng)抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質(zhì)類(lèi)（M9074-86）與假單胞菌、熱死環(huán)絲菌呈正相關(guān)，且相關(guān)性較大，說(shuō)明這5 種蛋白質(zhì)的存在有益于假單胞菌和熱死環(huán)絲菌的生存；角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)3-1（M10359-3）與假單胞菌、熱死環(huán)絲菌呈負(fù)相關(guān)，且相關(guān)性較大，說(shuō)明L40M6199-14抑制這兩種菌的生存。

角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質(zhì)C-II（M8136-55）與埃希氏菌和乳酸桿菌呈正相關(guān)，且相關(guān)性較大，說(shuō)明這3 種蛋白質(zhì)有益于埃希氏菌和乳酸桿菌的生存；GRF/GHRH生長(zhǎng)激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質(zhì)（M7709-26）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3）與其呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性較大，說(shuō)明這3 種蛋白質(zhì)會(huì)抑制埃希氏菌和乳酸桿菌的生存；由上述可知，PCA及相關(guān)性熱力圖的結(jié)果相似，二者之間可以相互補(bǔ)充及驗(yàn)證。

微生物一般利用體內(nèi)酶將非蛋白氮類(lèi)物質(zhì)降解為氨，氨在酶的催化下同化為氨基酸，氨基酸經(jīng)過(guò)體內(nèi)的代謝最終合成自身生長(zhǎng)需要的菌體蛋白質(zhì)[30]。而微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中能夠產(chǎn)生一些抑菌和殺菌效果的活性物質(zhì)，如溶菌酶、ε-聚賴氨酸、苯乳酸、乳酸菌肽[31]。根據(jù)上述結(jié)論可初步判定：假單胞菌屬和熱死環(huán)絲菌是冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌，且致腐能力強(qiáng)，與之呈正相關(guān)的壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L、生長(zhǎng)抑制素-28、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1、朊蛋白質(zhì)類(lèi)促進(jìn)了假單胞菌和熱死環(huán)絲菌的增長(zhǎng)，與之呈負(fù)相關(guān)的角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)3-1抑制了假單胞菌和熱死環(huán)絲菌的增長(zhǎng)；與埃希氏菌和乳酸桿菌呈正相關(guān)的角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)8-1、抗菌肽及磷載脂蛋白質(zhì)C-II促進(jìn)了其增長(zhǎng)，與之呈負(fù)相關(guān)GRF/GHRH生長(zhǎng)激素釋放素、ATP合成蛋白質(zhì)、載脂蛋白質(zhì)E會(huì)逐漸被優(yōu)勢(shì)菌降解，亦降低了它們的增長(zhǎng)趨勢(shì)，抑制了埃希氏菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖。

3 結(jié) 論

冷鮮灘羊肉微生物群落演替是從復(fù)雜到簡(jiǎn)單的過(guò)程，即進(jìn)行逆行演替。本研究采用宏基因組技術(shù)通過(guò)對(duì)菌群組成分析，對(duì)比了冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)狀況，確定了寧夏鹽池地區(qū)冷鮮灘羊肉的優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌、埃希氏菌、熱死環(huán)絲菌及乳酸桿菌；并指出其中的優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌，其次為熱死環(huán)絲菌。為探明微生物菌體蛋白質(zhì)與菌落演替的關(guān)聯(lián)性，采用PCA及熱力圖分析，結(jié)果表明：在貯藏過(guò)程中，隨著假單胞菌和熱死環(huán)絲菌漸成為優(yōu)勢(shì)菌，壞死誘導(dǎo)疫霉蛋白質(zhì)（M8414-05）、N A D H-泛醌氧化還原酶鏈4 L（M 1 0 8 8 0-9）、生長(zhǎng)抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復(fù)合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質(zhì)類(lèi)（M9074-86）同時(shí)成為菌生長(zhǎng)繁殖的主要蛋白質(zhì)；角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)3-1（M10359-3）卻逐漸被菌所降解。乳酸桿菌和埃希氏菌所占含量百分比的上升，導(dǎo)致角蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質(zhì)C-II（M8136-55）也成為菌生長(zhǎng)繁殖的主要蛋白質(zhì)；GRF/GHRH 生長(zhǎng)激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質(zhì)（M7709-26）、載脂蛋白質(zhì)E（M34203-3） 所占含量比例的下降，說(shuō)明在菌的生長(zhǎng)過(guò)程中這幾種蛋白質(zhì)被緩慢降解，或被取代。