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    冷鮮牛肉貯藏中菌群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌致腐性的分析

    2019-10-08 03:48:42顧春濤畢偉偉朱軍莉
    食品科學(xué) 2019年18期
    關(guān)鍵詞:高通量冷藏單胞菌

    顧春濤,畢偉偉,朱軍莉*

    (浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018)

    牛肉是中國僅次于豬肉的第二大消耗肉品,具有較好的行業(yè)前景。冷鮮肉能良好地保持肉品風(fēng)味和營養(yǎng)價值,逐漸成為肉類消費(fèi)的主流。冷鮮牛肉品質(zhì)與其微生物種類及數(shù)量密切相關(guān),在冷鏈貯運(yùn)中由于嗜冷微生物繁殖代謝不斷積累醛、酮、胺、有機(jī)酸等物質(zhì)[1],導(dǎo)致牛肉腐敗變質(zhì)。牛肉微生物菌群在貯藏過程的增長,導(dǎo)致牛肉品質(zhì)下降,與牛肉的貨架期密切相關(guān)[2]。在肉品復(fù)雜的微生物菌群中,只有一種或幾種特定腐敗菌在腐敗進(jìn)程中起著主導(dǎo)作用。

    生鮮食品貯藏過程中菌群落鑒定主要依賴培養(yǎng),它是實(shí)驗(yàn)室鑒定微生物最常用的方法,能簡便地計算出樣品中活菌的數(shù)量,并且是檢測某些特定腐敗菌的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。然而,培養(yǎng)方法可能很難檢測出數(shù)量較少的特定微生物種屬[4],并且由于培養(yǎng)基成分不能滿足所有微生物的營養(yǎng)要求,及化學(xué)物質(zhì)敏感度或者選擇性不理想,會導(dǎo)致錯估微生物的菌群落結(jié)構(gòu)[5]。隨著分子生物學(xué)分析技術(shù)快速發(fā)展,高通量測序技術(shù)具有較好定量、節(jié)約時間、較精準(zhǔn)地檢測大多數(shù)菌種等優(yōu)點(diǎn),逐步應(yīng)用于食品微生物菌群結(jié)構(gòu)分析[6]。采用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)真空包裝豬肉中微球菌、腸桿菌、乳酸菌和肉桿菌是主要腐敗菌[7]。而高通量測序也存在一定問題,如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增可能導(dǎo)致錯誤的相對豐度及產(chǎn)生嵌合序列[8]。因此,在食品復(fù)雜體系中的微生物菌群研究中需將培養(yǎng)依賴和培養(yǎng)非依賴的技術(shù)相結(jié)合。

    目前冷鮮肉類的研究主要集中在貯藏品質(zhì)變化、腐敗菌分離鑒定和新保鮮技術(shù)研發(fā)[9-10],而冷鏈中牛肉微生物菌群結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢菌致腐能力的系統(tǒng)研究仍較少。鑒于此,本研究以牛肉為研究對象,采用依賴培養(yǎng)的16S rDNA測序結(jié)合非培養(yǎng)的高通量測序分析牛肉在0 ℃貯藏的微生物菌群變化,鑒定冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌,評價其致腐性。研究為較全面了解冷鮮牛肉中微生物動態(tài)變化,分析主要特定腐敗菌,以期為靶向抑制腐敗菌生長,為高品質(zhì)牛肉冷鮮技術(shù)的研發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牛肉由高沙農(nóng)貿(mào)市場提供,黃牛屠宰后,4 ℃充分冷卻排酸72 h,中心溫度降至0~4 ℃后取腰大肌(里脊)部位,冰運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,在無菌環(huán)境中分割成50 g左右小塊,置于塑料托盤中,覆蓋聚乙烯膜于(0±1)℃貯藏。本實(shí)驗(yàn)微生物分析牛肉樣品均為同一批次產(chǎn)品,且牛肉汁制作所用牛肉也為同一批次產(chǎn)品。

    平板計數(shù)瓊脂(plate count agar,PCA)、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、熱死環(huán)絲菌STAA分離培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar,VRBA)和乳酸菌MRS(De Man, Rogosa and Sharpe)分離培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯肉湯(brilliant green lactose bile broth,BGLB) 青島海博生物技術(shù)有限公司;高通量測序細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒 美國Omega公司;Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒美國Thermo Fisher Scientific公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 日本BioFlux公司;PCR全套試劑 日本TaKaRa公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;NaCl、干酪素、Na2CO3、H3BO3、甲基紅、溴甲酚綠(均為分析純)、HCl(0.1 mol/L) 上海阿拉丁公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BXM-75VE型高壓滅菌鍋、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱上海博訊公司;DYY-2c型電泳儀 北京六一儀器廠;QuantiFluor熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司;MiSeq測序儀 美國Illumina公司;3-18K型離心機(jī) 德國Sigma公司;UV-1800型紫外分光光度計 日本Shimadzu公司;FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計 瑞士梅特勒-托利多公司;

    KDN-103F型凱氏定氮儀 上海華燁公司。

    1.3 方法

    1.3.1 牛肉感官評分

    參考鄭加旭等[11]的感官評分方法,以可接受度作為感官評價標(biāo)準(zhǔn),牛肉在0 ℃冷藏,每3 d定期取樣品,由6 名經(jīng)過訓(xùn)練的評價員評估其感官評分。0~3 分為好;3~6 分為中;6~9 分為差。

    1.3.2 牛肉細(xì)菌總數(shù)測定

    牛肉樣品在0 ℃冷藏,每3 d定期取樣,參考GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測定》[12]測定菌落總數(shù),假單胞菌數(shù)、熱死環(huán)絲菌數(shù)、乳酸菌數(shù)與菌落總數(shù)測定方法相似,分別用CFC瓊脂、STAA瓊脂、MRS瓊脂和PCA計數(shù),其中PCA和CFC瓊脂于30 ℃培養(yǎng)48 h,STAA瓊脂于22 ℃培養(yǎng)48 h。腸桿菌數(shù)參考GB 4789.3—2016《大腸菌群計數(shù)》[13]測定,用VRBA瓊脂計數(shù)。

    1.3.3 細(xì)菌分離和16S rDNA鑒定

    將冷鮮牛肉在貯藏初期0 d和末期2 1 d樣品培養(yǎng)后,挑取P C A上外觀形態(tài)不同的菌落1 3 株和1 5 株,純化后,挑取單菌落,進(jìn)行革蘭氏染色,并提取基因組D N A,用通用引物[14]1 6 S F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16S R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)擴(kuò)增16S rDNA片段,測序及拼接序列后,在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進(jìn)行核酸序列的同源性比對。

    1.3.4 高通量測序

    取采集的牛肉樣品各5 g,加入45 mL無菌生理鹽水,4 ℃條件下?lián)u床中振蕩2 h,4 ℃、200×g離心2 min,取上清液12 000×g再次離心2 min,棄上清液,收集沉淀。

    DNA提?。簯?yīng)用OMEGA公司的DNA提取試劑盒提取上述沉淀中的細(xì)菌基因組DNA,用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。

    PCR擴(kuò)增及高通量測序:采用通用引物[15]515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。反應(yīng)條件均為98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。對純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒在QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對基因文庫進(jìn)行定量;使用MiSeq測序儀進(jìn)行雙端測序。

    數(shù)據(jù)分析處理,將測序獲得的雙端數(shù)據(jù)拼接成長的tag,并將序列上建庫引入的barcode和引物序列去除。此外,按照熒光信號強(qiáng)度修剪質(zhì)量值低的序列。利用Vsearch(https://github.com/torognes/vsearch)對序列進(jìn)行聚類,通過操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)的Alpha多樣性分析得到樣品中OTU數(shù)目(豐富度)和群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(均勻度)[16]。通過OTU稀釋曲線分析,評估測序量是否達(dá)標(biāo)。并與RDP數(shù)據(jù)庫和NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對,選取豐度大于0.5%的物種分類,將其余的物種設(shè)置為others,以BIOM格式OTU表統(tǒng)計OTU豐度[17]。

    1.3.5 無菌牛肉汁的制備和接種

    無菌牛肉汁提取參考劉永吉[18]的方法,略作修改。具體如下:將100 g新鮮牛肉切碎后,用200 mL無菌水拍打成勻漿液,4 ℃、5 000×g離心15 min,將上清液過0.22 μm無菌濾膜后備用。將貯藏末期的15 株分離株過夜培養(yǎng)物,用生理鹽水稀釋至106~107CFU/mL,以1%接種到無菌牛肉汁,使初始濃度保持在104~105CFU/mL。牛肉汁在0 ℃冷藏,在第6、15天取樣進(jìn)行感官、pH值和揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)值檢測,以接種無菌水的樣品作空白對照。

    1.3.6 牛肉汁中感官和蛋白酶測定

    取牛肉汁樣品5 mL,感官評價參考1.3.1節(jié)方法。并取牛肉汁1.5 mL在4 ℃、10 000×g離心10 min,上清液0.22 μm無菌濾膜后,參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[19]中的福林-酚方法測定蛋白酶活力。

    1.3.7 牛肉汁中pH值和TVB-N值測定

    牛肉汁混勻,離心,上清液0.22 μm無菌濾膜后,參照pH計說明書和GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[20]半微量定氮法測定pH值和TVB-N值。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

    牛肉冷藏中微生物鑒定實(shí)驗(yàn)和牛肉汁評價腐敗分離株致腐性均設(shè)計3 個重復(fù),采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件(OriginLab公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖,并利用SPSS 19.0軟件(IBM公司)的AVOVA進(jìn)行方差分析,P<0.05,差異顯著,結(jié)果為。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 冷鮮牛肉感官評分腐敗菌總數(shù)變化

    如圖1所示,牛肉在冷藏前9 d感官品質(zhì)保持較好,第12天肉品新鮮度下降,第15天出現(xiàn)異味,第18天樣品有酸敗味,感官品質(zhì)不可接受。冷鮮牛肉初始(0 d)菌落總數(shù)為4.06(lg(CFU/g)),表明樣品品質(zhì)良好。牛肉在0 ℃貯藏初期微生物緩慢增加,第3天增長快速,至第9天超過6(lg(CFU/g)),而第15天達(dá)到8.73(lg(CFU/g)),之后達(dá)到穩(wěn)定。牛肉在冷藏中CFC瓊脂上假單胞菌數(shù)、STAA瓊脂上熱死環(huán)絲菌數(shù)、VRBA瓊脂上腸桿菌數(shù)和MRS瓊脂上乳酸菌數(shù)不斷上升,其增長趨勢與菌落總數(shù)相似,其中假單胞菌數(shù)和熱死環(huán)絲菌數(shù)增長最快,腸桿菌數(shù)和乳酸菌數(shù)的增長較慢。牛肉貯藏末期假單胞菌數(shù)最高,熱死環(huán)絲菌次之,而腸桿菌數(shù)和乳酸菌數(shù)低于假單胞菌約2(lg(CFU/g))(P<0.05)。結(jié)合感官評價和菌落總數(shù),0 ℃冷藏牛肉的貨架期約為15 d。

    圖1 牛肉0 ℃貯藏時感官評分和菌落數(shù)的變化Fig. 1 Changes in sensory score and microbial load of beef stored at 0 ℃

    2.2 冷鮮牛肉菌相的16S rDNA鑒定

    圖2 冷鮮牛肉新鮮肉和腐敗肉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異Fig. 2 Bacterial community structures of all samples at the genus level

    從新鮮牛肉和腐敗牛肉樣品分別挑選具有特異性形態(tài)的菌落13 株和15 株,經(jīng)純化及初步鑒定后發(fā)現(xiàn)新鮮肉和腐敗肉分別有9 株和11 株為革蘭氏陰性菌,表明牛肉中腐敗微生物菌群主要以革蘭氏陰性菌為主。將28 株菌以16S rDNA 通用引物PCR擴(kuò)增,測序后得到的序列采用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST進(jìn)行同源性比對顯示,新鮮肉分離株中有4 株與熱死環(huán)絲菌有較高的同源性,約占30.77%;3 株與氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)有較高的同源性,占23.08%,有2 株與不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)有較高的同源性,約占15.38%,還有4 株分別與假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)和摩根氏菌屬(Morganellaspp.)同源性較高,各占7.69%(圖2)。而腐敗肉有10 株與假單胞菌有較高的同源性,約占66.67%,4 株與熱死環(huán)絲菌同源性較高,約占26.67%,還有1 株與蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)同源性較高,占6.67%。培養(yǎng)及生理生化特征結(jié)果顯示好氧革蘭陰性菌假單胞菌和陽性菌熱死環(huán)絲菌是冷鮮牛肉有氧貯藏下的優(yōu)勢腐敗菌[21],Pennacchia等[22]對冷鮮牛肉可培養(yǎng)微生物群的高通量測序,發(fā)現(xiàn)貯藏20 d后假單胞菌等為優(yōu)勢腐敗菌,還有某些嗜冷腸桿菌,如格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)等。

    2.3 冷鮮牛肉微生物高通量檢測分析

    采用高通量測序技術(shù)進(jìn)一步分析冷鮮牛肉初始和腐敗樣品菌群分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)104 個屬的細(xì)菌和部分未分類的細(xì)菌被挖掘,其中新鮮牛肉中有89 種,腐敗牛肉中有43 種,其中兩個樣品中共有OTU數(shù)為27。選取其中相對豐度大于0.5%的7 個物種分類,繪制樣品豐度堆疊柱狀圖。如圖2所示,冷鮮牛肉貯藏前期的優(yōu)勢菌為嗜冷桿菌屬(Psychrobacterspp.,34.78%)、假單胞菌屬(22.64%)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.,12.21%)、棒狀桿菌屬(Corynebacteriumspp.,8.44%)、不動桿菌屬(7.76%)。而貨架末期的優(yōu)勢菌為假單胞菌屬(82.78%)、環(huán)絲菌屬(13.11%)、乳桿菌屬(1.90%)、嗜冷桿菌屬(1.27%)。Ercolini等[23]使用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),牛肉低溫有氧和高氧貯藏下假單胞菌是主要腐敗菌。Ercolini等[24]運(yùn)用該技術(shù)分析顯示牛肉在低溫普通和氣調(diào)包裝初期微生物主要為假單胞菌和熱死環(huán)絲菌,而貯藏后期普通包裝假單胞菌優(yōu)勢生長,氣調(diào)包裝乳酸菌占優(yōu)勢。

    上述結(jié)果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)依賴16S rDNA結(jié)合不依賴培養(yǎng)高通量測序分析菌群種類基本相似,冷鮮牛肉初始菌相復(fù)雜,主要由熱死環(huán)絲菌、嗜冷菌、假單胞菌、不動桿菌、氣單胞菌等多種微生物構(gòu)成。隨著冷藏期的延長牛肉中腐敗菌相趨于簡單,其中假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為優(yōu)勢腐敗菌,占主導(dǎo)地位。然而兩種方法在鑒定部分微生物種屬中仍存在一定偏差,特別是新鮮肉樣。通過培養(yǎng)依賴16S rDNA方法在新鮮牛肉未鑒定到嗜冷桿菌、乳桿菌、棒狀桿菌和溶桿菌,與PCA營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件的限制,導(dǎo)致這些菌不能生長有關(guān)。而培養(yǎng)依賴方法中發(fā)現(xiàn)的變形桿菌、克雷伯氏菌和摩根氏菌未能在高通量測序中找到,可能因其相對豐度過低,未被擴(kuò)增。

    表1 腐敗肉假單胞菌分離株16S rDNA序列同源性分析Table 1 Homology analysis of 16S rDNA genes of Pseudomonas isolates

    研究發(fā)現(xiàn)腐敗牛肉中假單胞菌是優(yōu)勢腐敗菌,如表1所示。同源性發(fā)現(xiàn)致腐菌假單胞菌中PS28、PS16、PS30、PS18、PS29、PS19六株與莓實(shí)假單胞菌(P. fragi)有較高同源性,PS26和PS20與嗜冷假單胞菌(P. psychrophila)有較高同源性,另外PS17與隆德假單胞菌(P. lundensis)、PS27與拉丁假單胞菌(P. lurida)有較高同源性。Casaburi等[25]相似地報道莓實(shí)假單胞菌是肉類中最常見假單胞菌,其次是隆德假單胞菌和熒光假單胞菌。Ercolini等[26]發(fā)現(xiàn)假單胞菌是有氧保藏冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌,所有莓實(shí)假單胞菌均能產(chǎn)生酯類揮發(fā)性物質(zhì),對肉類腐敗起到重要作用??梢?,莓實(shí)假單胞菌是冷鮮牛肉的優(yōu)勢腐敗菌。

    2.4 優(yōu)勢腐敗菌在牛肉汁中致腐性評價

    2.4.1 細(xì)菌生長

    無菌牛肉汁可以提供牛肉中可作為能量和營養(yǎng)來源的物質(zhì),為一種近似牛肉的營養(yǎng)介質(zhì)。細(xì)菌生長是細(xì)菌腐敗能力顯現(xiàn)的重要方面,在無菌牛肉汁中評價其生長特性,可以更客觀地模擬腐敗菌在牛肉中生長繁殖。牛肉汁空白組在貯藏期內(nèi)無細(xì)菌生長。如圖3所示,在貨架期前期(6 d),接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈夫尼菌組分別達(dá)到7.23~7.33、6.80~7.10(lg(CFU/mL))和6.81(lg(CFU/mL))。在貨架期末期(15 d),接種牛肉汁的菌液濃度熱死環(huán)絲菌組達(dá)到8.43~8.50(lg(CFU/mL)),假單胞菌組為7.58~7.95(lg(CFU/mL)),而蜂房哈夫尼菌的菌液濃度達(dá)到8.46(lg(CFU/mL))。在3 種優(yōu)勢腐敗菌中熱死環(huán)絲菌和哈夫尼細(xì)菌菌液濃度較高,假單胞菌菌液濃度較低。

    圖3 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的菌體生長Fig. 3 Growth rates of Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia inoculated in sterilized beef juice stored at 0 ℃

    2.4.2 感官評定

    感官評定是評價肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo),因微生物生長繁殖過程中利用肉類蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),逐步積累代謝降解產(chǎn)物,導(dǎo)致牛肉汁出現(xiàn)渾濁、散發(fā)酸臭味和硫化氫味等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。如圖4所示,牛肉汁空白組感官評價良好。而接菌組感官品質(zhì)均呈下降趨勢,較空白組感官變化明顯。冷藏6 d接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈夫尼菌組的感官評分分別達(dá)到1.33~2.17、2.67~6.33和4.00。15 d接種牛肉汁的感官評分熱死環(huán)絲菌組達(dá)到3.17~4.50;假單胞菌組為6.00~8.33,不可接受;而蜂房哈夫尼菌的感官評分達(dá)到8.33,也不可接受。在3 種優(yōu)勢腐敗菌中假單胞菌和哈夫尼細(xì)菌感官變化較快,其中莓實(shí)假單胞菌PS28最高,其次為PS30、PS26和PS27。假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌代謝利用氨基酸,釋放NH3等刺激性氣體,導(dǎo)致感官快速劣變[27]。而熱死環(huán)絲菌感官變化較小,可能與該菌在有氧條件下利用葡萄糖生成乙偶姻及乙酸,產(chǎn)生甜的氣味[28]有關(guān)。

    圖4 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的感官評分Fig. 4 Sensory scores of sterilized beef juice inoculated with Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia during storage at 0 ℃

    2.4.3 蛋白酶活性

    圖5 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的蛋白酶活性變化Fig. 5 Changes in protease activity of Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia inoculated in sterilized beef juice during storage at 0 ℃

    食品腐敗菌能夠分泌蛋白酶,分解動物性產(chǎn)品中的蛋白質(zhì),促進(jìn)微生物大量增殖,導(dǎo)致肉類腐敗。如圖5所示,熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和蜂房哈夫尼菌優(yōu)勢腐敗菌蛋白酶活性在第6天變化較小,僅發(fā)現(xiàn)假單胞菌PS26、PS20、PS16、PS27、PS28、PS29和PS30表現(xiàn)蛋白酶活性(P<0.05),除PS30外在冷藏至第15天顯著增加(P<0.05),分別達(dá)到32.13、5.66、3.00、10.77、10.62、1.40 U/mL,其中莓實(shí)假單胞菌PS26最高,其次為PS27和PS28。假單胞菌的蛋白酶活性具有菌株依賴[29],而熱死環(huán)絲菌和蜂房哈夫尼菌未有蛋白酶活性。

    2.4.4 pH值

    圖6 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的pH值變化Fig. 6 Changes in pH value of sterilized beef juice inoculated with Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia during storage at 0 ℃

    如圖6所示,牛肉汁空白組初期pH值為6.10,冷藏15 d無變化(P>0.05)。熱死環(huán)絲菌組冷藏6 d pH值下降至5.09~5.41(P<0.05),假單胞菌組pH值上升至6.08~6.85(P<0.05),蜂房哈夫尼菌組pH值達(dá)到6.23。貯藏至第15天,熱死環(huán)絲菌組中除BT7下降外其余無明顯降低(P>0.05),假單胞菌組中PS16、PS17、PS19、PS26、PS27菌pH值顯著上升(P<0.05),增至6.28~6.82,其余組無顯著變化(P>0.05);接種蜂房哈夫尼菌牛肉汁pH值為6.27。研究發(fā)現(xiàn)接種熱死環(huán)絲菌BT7和BT10的pH值最低,而接種假單胞菌PS28的pH值最高,達(dá)到7.18。冷藏牛肉汁的pH值變化與微生物代謝產(chǎn)物的積累有關(guān),研究表明熱死環(huán)絲菌在有氧條件下以纈氨酸和亮氨酸為底物產(chǎn)生揮發(fā)性酸,導(dǎo)致牛肉汁pH值降低[28],而假單胞菌和腸桿菌科細(xì)菌代謝利用蛋白質(zhì),釋放氨等堿性物質(zhì),導(dǎo)致肉類pH值上升[30]。

    2.4.5 TVB-N值

    圖7 熱死環(huán)絲菌、假單胞菌和哈夫尼菌在0 ℃牛肉汁中的TVB-N值變化Fig. 7 Changes in TVB-N value of sterilized beef juice inoculated with Brochothrix, Pseudomonas and Hafnia during storage at 0 ℃

    牛肉冷藏期間TVB-N的累積是由于在微生物和酶的作用下,引起蛋白質(zhì)的脫氨、脫羧作用,降解產(chǎn)生氨及胺類等揮發(fā)性的堿性含氮物質(zhì),是評價肉質(zhì)新鮮度最重要的指標(biāo)。從圖7可知,無菌牛肉汁初期TVB-N值為5.25 mg/100 mL。接種熱死環(huán)絲菌組、假單胞菌組和蜂房哈夫尼菌組在冷藏至第6天時,TVB-N值分別為6.30~7.00、5.60~10.85 mg/100 mL和7.00 mg/100 mL。冷藏15 d熱死環(huán)絲菌組中TVB-N值上升至8.23~8.58 mg/100 mL,假單胞菌組中除PS16和PS30外,其余接種牛肉汁TVB-N值上升至8.23~15.23 mg/100 mL(P<0.05),其中莓實(shí)假單胞菌PS28菌株上升最快(P<0.05);而接種蜂房哈夫尼菌牛肉汁的TVB-N值達(dá)到8.23 mg/100 mL。

    腐敗末期3 種優(yōu)勢腐敗菌均能在冷藏條件下緩慢生長,且表現(xiàn)不同的致腐性,假單胞菌和蜂房哈夫尼菌感官評分、pH值和TVB-N值高于熱死環(huán)絲菌,提示這兩種致腐菌能形成氨類代謝產(chǎn)物。并且假單胞菌表現(xiàn)較強(qiáng)的蛋白酶活性。從雞肉中分離出致腐性沙雷氏菌、假單胞菌和殺鮭氣單胞菌,也顯示假單胞菌組TVB-N值、pH值均高于其他分離菌,且異味和黏液分泌明顯[31]。而接種的熱死環(huán)絲菌對真空包裝牛肉感官影響較小[32]。Gribble等[33]對接種熱死環(huán)絲菌和腸桿菌的真空包裝羊肉的顏色、氣味以及產(chǎn)氣能力評價顯示腸桿菌致腐性更強(qiáng),更早形成腐敗。在多株牛肉源的假單胞菌分離株中莓實(shí)假單胞菌PS28致腐性最強(qiáng),相似地報道莓實(shí)假單胞菌形成酯、酮、醇、硫化合物等多種不良的風(fēng)味物質(zhì)[25]。

    3 結(jié) 論

    研究采用培養(yǎng)依賴16S rDNA鑒定結(jié)合高通量測序技術(shù)較詳實(shí)地分析冷鮮牛肉冷藏中微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)冷鮮牛肉貯藏初期細(xì)菌表現(xiàn)多樣性,而腐敗終點(diǎn)菌群種類明顯下降,以假單胞菌和熱死環(huán)絲菌為優(yōu)勢腐敗菌。腐敗末期優(yōu)勢腐敗菌表現(xiàn)不同的致腐性,其中假單胞菌和蜂房哈夫尼菌致腐性強(qiáng)于熱死環(huán)絲菌,假單胞菌還表現(xiàn)較強(qiáng)的蛋白酶活性,其中莓實(shí)假單胞菌PS28致腐性最強(qiáng)??梢?,冷鮮牛肉中的特定腐敗菌是莓實(shí)假單胞菌。

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