兩種常用氯氰菊酯對秀麗隱桿線蟲生殖發(fā)育影響的信號轉(zhuǎn)導通路

余雪鋒，耿文敬，郭肖穎，朱 江

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031）

氯氰菊酯（Cypermethrin，CPM），是繼有機磷、有機氯等農(nóng)藥之后發(fā)展起來的一類新型殺蟲劑，被廣泛應用于棉花、蔬菜、大豆和甜菜等作物害蟲的防治[1]。順式氯氰菊酯（α-CPM）和高效氯氰菊酯（β-CPM）具有殺蟲譜廣、殺蟲效率高、生產(chǎn)成本低和工藝簡單等優(yōu)點，是擬除蟲菊酯類殺蟲劑中應用范圍廣、使用量大的菊酯類農(nóng)藥[2-3]。

CPM環(huán)境穩(wěn)定性強，不易被光和空氣降解。世界衛(wèi)生組織將CPM定性為中等毒性，歐盟規(guī)定水產(chǎn)品中 CPM 最高殘留量為 50 μg·kg-1[4]。Kumari等[5]在印度的棉花-小麥和水稻-小麥輪作田地和甘蔗地檢測到CPM殘留量為1～35μg·kg-1。宋國春等[6]研究發(fā)現(xiàn)青花菜中CPM殘留量為0.160～0.397 mg·kg-1。余正萍[7]測定出CPM在四川黃瓜山果園摘取的黃桃、名豪超市購買的梨和永川重百超市購買的蘋果殘留量為0.009 0～0.017 9 mg·L-1。CPM殘留可通過食物鏈進入人體，危害人體健康[8]。

CPM已被美國環(huán)境保護局（U.S.Environmental Protection Agency，USEPA）認定為可疑致癌物[9]。有研究顯示，CPM暴露可誘導機體的生殖毒性[4]。Undeger等[10]研究表明200 g·L-1的CPM顯著增加人體淋巴細胞DNA損傷。馬萍等[11]研究發(fā)現(xiàn)β-CPM（≥20 mg·kg-1）造成小鼠神經(jīng)細胞DNA和腦組織氧化損傷，且有劑量效應。阮秦莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)將L4期野生型秀麗隱桿線蟲暴露于8.0 mg·L-1的CPM 48 h后產(chǎn)卵數(shù)目明顯降低。Wang等[13]研究表明哺乳期小鼠母體暴露于6.25 mg·kg-1的CPM可導致雄性子代睪丸發(fā)育和精子發(fā)生長期損害。目前，CPM對機體生殖損傷的相關(guān)作用機理鮮有報道，尤其關(guān)于CPM作用于機體生殖毒性損傷信號傳導途徑的研究幾乎尚未涉及。基于此，本文以秀麗隱桿線蟲作為實驗動物，以線蟲生殖細胞凋亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率作為生物檢測終點，開展兩種常用氯氰菊酯α-CPM和β-CPM作用于機體的生殖毒性效應，并探索生殖損傷發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導通路，探討相關(guān)作用機理，為評估α-CPM和β-CPM暴露的健康危害性提供理論研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 線蟲品系與培養(yǎng)

N2 Brisitol野生型。

ced-3（mt1522）、ced-4（mt2547），屬于 caspase缺失，缺乏生理性細胞凋亡和遺傳性誘導的生殖細胞凋亡。

cep-1（jr1279），為p53基因突變，具有生理性細胞凋亡。

hus-1（ws2277）為DNA損傷響應基因突變，具有生理性的生殖細胞凋亡，但缺乏誘導輻射的細胞凋亡和生殖細胞周期停滯。

lin45（mh575）、mek-2（mt8666）、mpk（mh37）均為ERK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的成員。

mkk（cz4213）、jnk（vc8）、jkk（ku2）、mek-1（fk141）均為JNK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的成員。

nsy-1（au3）、sek-1（au1）、pmk（ku25）均 為 p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的成員。

以上所有線蟲品系均由美國NIH資助的國際線蟲種質(zhì)中心（CGC）贈送。將線蟲培養(yǎng)于含有大腸桿菌OP50的NGM平板固體培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium）上，20℃恒溫培養(yǎng)[14]。按照Donkin等[15]的方法同步化，獲得大量L4期線蟲。

1.2 主要試劑

α-CPM（順式氯氰菊酯標準品）：CAS NO：[67375-30-8]，產(chǎn)品貨號：ZDR-C11890100，中文名：alpha-氯氰菊酯，英文名：alpha-Cypermethrin，規(guī)格：0.1 g。分子量為416.30，難溶于水，在醇類、酮類和取代芳烴類有機溶劑中溶解＞450 g·L-1。

β-CPM（高效氯氰菊酯標準品）：CAS NO：[72204-43-4]，產(chǎn)品貨號：ZDR-C11890200，中文名：beta-氯氰菊酯，英文名：beta-Cypermethrin，規(guī)格：0.1 g。分子量為416.30，難溶于水，在醇類、酮類和取代芳烴類有機溶劑中溶解＞450 g·L-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 CPM毒性暴露試驗

CPM殺蟲劑難溶于水，易溶于有機溶劑。實驗以純丙酮溶液作為溶劑，將CPM配制成0.1 g·mL-1的母液。暴露溶液由母液以K-medium為溶劑梯度稀釋至 0.005、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1濃度，以 K-medium溶液作對照。將L4期線蟲接入到不同濃度CPM溶液的Costar 12孔組織培養(yǎng)板，加入2%E.coli OP50濃縮菌作為食物，配制成1 mL的培養(yǎng)液，置于20℃恒溫搖床，在24 h后將處理后的線蟲取出進行進一步分析。

文章應用線蟲生殖細胞死亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率作為生物檢測終點，研究α-CPM和β-CPM暴露對機體生殖發(fā)育的影響。將同步化的L4期線蟲或早期成蟲暴露于0.005、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計其生殖腺的死亡細胞數(shù)目、產(chǎn)卵量和卵孵化率。各對照組、暴露組的測定數(shù)目為15～20條線蟲。

0.005 、0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的CPM處理液中的丙酮濃度分別為：0.025、0.25、1、4、16 μL·mL-1，與K-medium對照相比均未出現(xiàn)顯著性差異（圖1），所以以丙酮為溶劑的CPM處理液中丙酮的濃度不影響線蟲生殖細胞凋亡的評價結(jié)果。

圖1 丙酮暴露誘導的線蟲生殖細胞死亡Figure 1 Acetone induced germ cells death in C.elegans

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均應用IBM SPSS Statistics 19.0分析，以平均值±標準差的形式表示，以Turkey多重比較檢驗不同濃度的α-CPM和β-CPM暴露對秀麗隱桿線蟲生殖發(fā)育的影響。利用雙尾t檢驗同一品系線蟲α-CPM和β-CPM不同暴露濃度所導致的細胞凋亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-CPM和β-CPM暴露誘導線蟲的生殖細胞死亡

圖2結(jié)果顯示，暴露于α-CPM的線蟲生殖細胞死亡數(shù)目在0.005～0.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈遞增趨勢，在0.05 mg·L-1已表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），并于0.2 mg·L-1達到最大值，而當α-CPM濃度增加至0.2～3.2 mg·L-1范圍時，線蟲生殖細胞死亡數(shù)目與0.2 mg·L-1暴露組相比呈先減少后增加的趨勢，且與對照相比均出現(xiàn)顯著性差異。暴露于β-CPM的線蟲生殖細胞死亡數(shù)目的變化趨勢與α-CPM基本一致。正常生長發(fā)育的線蟲，其生殖腺有絲分裂區(qū)的細胞排列緊致有序，細胞核大小均勻，而隨著α-CPM和β-CPM暴露濃度的增加，這種有序的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，且細胞數(shù)量明顯減少（圖3）。暴露于β-CPM的線蟲生殖細胞死亡數(shù)目與對照相比出現(xiàn)顯著性差異的濃度為0.005 mg·L-1。這一結(jié)果說明，以線蟲生殖細胞凋亡為檢測終點時，β-CPM暴露誘導顯著性生殖細胞死亡的濃度低于α-CPM，即β-CPM暴露對機體造成的生殖毒性較α-CPM大。

圖2 α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞死亡Figure 2 α-CPM and β-CPM induced germ cells death in C.elegans

較低濃度的α-CPM和β-CPM暴露均誘導線蟲發(fā)生顯著的生殖細胞凋亡，并于0.2 mg·L-1暴露濃度達到最大值，故在之后探究相關(guān)作用機理中，均選用0.2 mg·L-1作為供試濃度。

2.2 α-CPM和β-CPM暴露誘導的線蟲生殖細胞死亡依賴核心凋亡途徑

線蟲中，ced-3和ced-4是生殖細胞凋亡的核心調(diào)控基因，為明確α-CPM和β-CPM暴露誘導線蟲生殖細胞死亡是細胞壞死還是程序性的細胞凋亡，凋亡的細胞呈亮黃色，是DNA片斷化的一個重要標志，而未凋亡的細胞呈現(xiàn)均勻的淺綠色（圖4），將ced-3和ced-4基因缺陷型的線蟲品系ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進行染毒處理。圖5結(jié)果顯示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM的ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）線蟲，其單個生殖腺臂的生殖細胞死亡數(shù)目與對照相比無顯著性差異，而以0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM處理的野生型N2線蟲品系，其單個生殖腺臂的細胞死亡數(shù)目從對照的2.05±0.17分別增加至3.67±0.27和3.76±0.27（P＜0.01）。由于ced-3和ced-4基因是細胞凋亡所必需的，而α-CPM和β-CPM暴露不能使ced-3（mt1522）和ced-4（mt2547）基因缺陷型品系的AO陽性細胞數(shù)目增加，表明在野生型N2線蟲品系上所檢測的AO陽性細胞是凋亡細胞（圖5，P＞0.05）。且ced-3突變品系線蟲為caspase基因突變，缺乏caspase途徑會抑制生理性的生殖細胞凋亡，表明α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞死亡是依賴于ced-3和ced-4基因調(diào)控的細胞凋亡。

圖3 CPM暴露誘導的線蟲生殖腺有絲分裂細胞減少Figure 3 Decreased mitotic germline cells induced by CPM exposure in C.elegans

圖4 CPM誘導的線蟲細胞凋亡>Figure 4 CPM-induced germline apoptosis in C.elegans

圖5 α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞死亡依賴ced-3和ced-4基因的表達Figure 5 α-CPM and β-CPM-induced germ cell death dependent of ced-3 and ced-4 genes in C.elegans

2.3 α-CPM和β-CPM暴露誘導的線蟲生殖細胞凋亡不依賴DNA損傷信號通路

為研究α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡的途徑，將基因缺陷型品系cep-1（jr1279）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進行染毒處理，24 h后測定其生殖細胞凋亡數(shù)目。圖6結(jié)果顯示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和 β-CPM 的 cep-1（jr1279）線蟲品系，其生殖細胞凋亡細胞數(shù)目從對照的2.52±0.19分別增加至4.00±0.27和3.90±0.22，其增長趨勢與α-CPM和β-CPM染毒處理的野生型N2基本一致（P＜0.05），這一研究結(jié)果說明，cep-1基因的功能缺失不影響α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡，即α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡不依賴于cep-1的表達。

圖6 DNA損傷檢測點蛋白HUS-1和響應基因cep-1在α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡中的作用Figure 6 Roles of checkpoint protein HUS-1 and DDR gene cep-1 in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

為了研究hus-1基因是否參與調(diào)節(jié)α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡，將基因缺陷型品系hus-1（ws2277）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進行染毒處理，24 h后線蟲生殖細胞凋亡數(shù)目顯著增加（P＜0.01），圖6結(jié)果顯示，hus-1基因未參與α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡。綜合上述研究結(jié)果說明，α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡不依賴DNA損傷信號通路。

2.4 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑在α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡中的作用

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAPK有3個主要家族：ERK、JNK和p38 MAPK。文章探索了MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡中的作用。

2.4.1 α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡不依賴ERK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑

在C.elegans中，ERK信號轉(zhuǎn)導途徑成員有l(wèi)in-45（MAPKKK），mek-2（MAPKK）和 mpk-1（MAPK）。將基因敲除的線蟲品系lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及mpk-1（mh37）分別暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM進行染毒處理，圖7結(jié)果顯示，lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及 mpk-1（mh37）的生理性細胞凋亡數(shù)目分別為3.90±0.22、4.58±0.27、3.47±0.25，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，其細胞凋亡數(shù)目分別為 5.13±0.27、5.67±0.25、4.70±0.32，相對值分別為1.23、1.09、1.23，均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01）；暴露于0.2 mg·L-1的β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，其細胞凋亡數(shù)目分別為5.21±0.34、6.35±0.31、4.55±0.28，相對值分別為1.31、1.77、1.08，與未處理的自身對照相比亦出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01）。比較暴露于α-CPM和β-CPM的野生型N2與lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及 mpk-1（mh37）的相對值發(fā)現(xiàn)，lin-45（mh575）、mek-2（mt8666）以及mpk-1（mh37）增加的幅度基本與野生型N2一致，說明ERK信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)基因的突變并未阻止α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡，也就是說ERK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑不是α-CPM和β-CPM誘導線蟲生殖細胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導通路。

圖7 ERK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑在α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡中的作用Figure 7 Roles of ERK MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

2.4.2 α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡依賴JNK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑

在C.elegans中，JKK-1屬于JNK MAPK，MKK-4則是其激活蛋白。MKK-4在線蟲中有2個同源蛋白，分別為JKK-1和MEK-1。這些基因的缺失會使C.elegans對環(huán)境的脅迫敏感，如重金屬暴露和饑餓。將基因缺陷型品系 mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒處理24 h后觀察其生殖細胞的凋亡數(shù)目。圖8結(jié)果顯示，mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系中生殖細胞凋亡數(shù)目分別為3.52±0.26、3.21±0.18、4.42±0.29個和4.42±0.29個，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，其細胞凋亡數(shù)目分別為2.60±0.17、3.05±0.20、4.52±0.25個和 4.52±0.25 個，jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系線蟲與自身未處理對照相比均未達到顯著性差異（P＞0.05）；暴露于0.2 mg·L-1的β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，mek-1（fk171）、jnk-1（vc8）、jkk-1（ku2）和mkk-4（cz4213）品系中生殖細胞凋亡數(shù)目分別為3.35±0.26、2.63±0.17、4.83±0.29個和 4.83±0.29個，mek-1（fk171）、jkk-1（ku2）和 mkk-4（cz4213）與自身未處理對照相比均未達到顯著性差異（P＞0.05）。上述研究結(jié)果表明，JNK信號轉(zhuǎn)導途徑是α-CPM和β-CPM誘導生殖細胞凋亡所需要的。

圖8 JNK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑在α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡中的作用Figure 8 Roles of ERK MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

2.4.3 α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡部分依賴p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑

在C.elegans中，nsy-1編碼MAPKKK、SEK-1是MAPKK家族，以及PMK-1是p38 MAPK家族成員之一。將基因敲除品系nsy-1（au3）、sek-1（au1）和pmk（ku25）暴露于0.2 mg·L-1的a-CPM和β-CPM染毒培養(yǎng)24 h，圖9結(jié)果顯示，暴露于0.2 mg·L-1的α-CPM的nsy-1（au3）和sek-1（au1）線蟲品系，其生殖細胞凋亡數(shù)目分別由2.62±0.26和2.75±0.19上升至3.89±0.29和3.48±0.29（P＜0.05），而在pmk（ku25）品系中，其生殖細胞凋亡數(shù)目顯著降低（P＜0.05）；暴露于β-CPM的nsy-1（au3）、sek-1（au1）和pmk（ku25）的生殖細胞凋亡數(shù)目變化趨勢與α-CPM基本一致。綜合上述研究結(jié)果說明，nsy-1和sek-1基因的缺失不影響a-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡，而pmk基因的功能缺失減少了a-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡數(shù)目，該研究結(jié)果表明，a-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡部分依賴p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑。

2.5 α-CPM和β-CPM暴露對線蟲產(chǎn)卵量和卵孵化率的影響

圖9 p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑在α-CPM和β-CPM誘導的線蟲生殖細胞凋亡中的作用Figure 9 Roles of p38 MAPK signaling pathways in α-CPM and β-CPM-induced germ cell apoptosis

當前已有研究結(jié)果顯示，CPM暴露可誘導小鼠細胞周期阻滯及DNA損傷，且在接觸CPM的農(nóng)民的淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)了遺傳毒性效應。而本文以生殖細胞凋亡為生物檢測終點的結(jié)果顯示，α-CPM和β-CPM誘導的生殖細胞凋亡不依賴DNA損傷信號通路，為了明確α-CPM和β-CPM暴露是否引起機體的DNA損傷效應，研究了α-CPM和β-CPM暴露對線蟲的產(chǎn)卵量和卵孵化率的影響。

線蟲成蟲體內(nèi)卵的數(shù)目及產(chǎn)卵量代表線蟲生育后代的能力，是線蟲生殖發(fā)育的一個至關(guān)重要的指標。將同步化的L4期或早期成蟲暴露于0.05、0.2、0.8、3.2 mg·L-1的α-CPM和β-CPM染毒培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計其產(chǎn)卵數(shù)目和卵孵化率。圖10A結(jié)果顯示，暴露于α-CPM的線蟲產(chǎn)卵量在0.05～3.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈遞減趨勢（P＜0.01），具有劑量效應。暴露于β-CPM的線蟲產(chǎn)卵量的變化趨勢與α-CPM基本一致（P＜0.01）。圖10B結(jié)果顯示，暴露于α-CPM的線蟲卵孵化率在0.05～3.2 mg·L-1范圍內(nèi)呈遞減趨勢（P＜0.05），具有劑量效應。暴露于β-CPM的線蟲卵孵化率的變化趨勢與α-CPM基本一致（P＜0.01）。比較野生型N2 α-CPM和β-CPM產(chǎn)卵量和卵孵化率的相對值發(fā)現(xiàn)，β-CPM暴露誘導線蟲產(chǎn)卵量和卵孵化率的下降幅度較α-CPM大，且在0.05 mg·L-1的β-CPM的線蟲卵孵化率已表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜0.01）。上述結(jié)果說明，α-CPM和β-CPM的暴露誘導線蟲生殖腺受損，意味著造成機體的DNA損傷，提示它對線蟲生殖細胞可能具有遺傳毒性作用，β-CPM暴露對機體造成的生殖毒性較α-CPM大，與凋亡實驗結(jié)果一致。α-CPM和β-CPM暴露誘導線蟲DNA損傷的具體作用機理是未來研究的主要方向。

圖10 不同濃度α-CPM和β-CPM對線蟲產(chǎn)卵量和卵孵化率的影響Figure 10 The effect of different concentration α-CPM and β-CPM on brood size and hatching rate in C.elegans

3 討論

文獻顯示，線蟲生殖細胞凋亡對外界環(huán)境壓力非常敏感，已被應用于重金屬、輻射等環(huán)境健康的評價[16]。線蟲的子代數(shù)目和卵孵化率反映其繁殖能力，亦是機體響應環(huán)境脅迫引起生殖損傷的重要指標。本文以線蟲的生殖細胞凋亡、產(chǎn)卵量和卵孵化率作為生物檢測終點，0.05 mg·L-1的α-CPM和β-CPM暴露均誘導線蟲發(fā)生顯著的生殖細胞凋亡，在0.005～0.2 mg·L-1范圍內(nèi)較對照組呈遞增趨勢，暴露于0.8 mg·L-1的α-CPM和β-CPM的線蟲生殖細胞死亡數(shù)目低于暴露于0.2 mg·L-1濃度組，而在0.8～3.2 mg·L-1范圍內(nèi)較0.8 mg·L-1濃度組呈遞增趨勢。線蟲生殖細胞死亡數(shù)目取決于生殖腺有絲分裂區(qū)的細胞數(shù)量，并隨著線蟲生殖腺有絲分裂區(qū)細胞數(shù)的減少而減少[17]，暴露于0.2～0.8 mg·L-1范圍內(nèi)的線蟲，其生殖細胞凋亡與0.2 mg·L-1濃度組相比呈減少趨勢可能與α-CPM和β-CPM暴露誘導的有絲分裂生殖細胞數(shù)量減少有關(guān)[18]。

在C.elegans中，CEP-1是哺乳動物腫瘤抑制基因p53的同源蛋白，具有促進DNA損傷引起的細胞凋亡的功能[19]。在遺傳損傷條件下，線蟲生殖細胞凋亡需要DNA損傷響應cep-1的表達[20]。HUS-1是一個9∶1∶1的復合體，編碼了DNA損傷檢測點蛋白，是DNA損傷的感受因子[21]。檢測點基因突變阻止了由DNA損傷引起的凋亡，而不影響生理性生殖細胞凋亡。而本文進一步研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷不是α-CPM和β-CPM暴露誘導線蟲生殖細胞凋亡的關(guān)鍵信號通路。而除了DNA依賴性的細胞凋亡途徑，環(huán)境脅迫還可誘導線蟲中非遺傳損傷的凋亡信號通路。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，屬于絲氨酸/酸酸蛋白激酶，可被多種刺激所活化[22]。MAPK 有 3個主要家族：ERK、JNK 和 p38 MAPK，在C.elegans均可找到其同源蛋白，因此，C.elegans亦含有3條主要的MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑，ERK、JNK和p38 MAPK[23-24]。結(jié)果顯示α-CPM和β-CPM暴露誘導的線蟲生殖細胞凋亡依賴JNK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑，部分依賴p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑，而不依賴ERK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑，與低濃度全氟辛烷磺?；淃}（PFOS）處理的線蟲作用機理相似[25]。

產(chǎn)卵孵化的結(jié)果顯示暴露于0.05、0.2、0.8、3.2 mg L-1的α-CPM和β-CPM的線蟲產(chǎn)生后代的數(shù)目減少和卵孵化率降低，意味著造成DNA損傷，對生殖細胞具有潛在的基因毒性作用，與阮秦莉等[12]研究結(jié)論相一致，具體的作用機理是未來研究的主要方向。線蟲的性腺可能是α-CPM和β-CPM的靶器官，造成線蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能異常，并能通過母體影響子代的發(fā)育[26]。其中暴露于β-CPM的產(chǎn)卵量和卵孵化率下降幅度較大，在一定程度上說明β-CPM的生殖毒性更強，與凋亡實驗結(jié)果一致。本文研究結(jié)果可以為α-CPM和β-CPM系統(tǒng)地評估生態(tài)風險提供依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）α-CPM和β-CPM暴露誘導線蟲發(fā)生顯著的生殖細胞凋亡，且β-CPM生殖毒性較α-CPM大。

（2）α-CPM和β-CPM暴露誘導的線蟲生殖細胞凋亡依賴JNK MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑，部分依賴p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑。

（3）α-CPM和β-CPM暴露誘導線蟲產(chǎn)卵量顯著減少和孵化率顯著降低，且β-CPM生殖毒性較α-CPM大。