STAT3及其靶基因STAT3在聲門上喉癌手術切緣組織中蛋白的表達及與預后的關系

張紅蕾 李佳 李大鵬 王榮麗 郭睿

(1. 中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心耳鼻咽喉頭頸外科 北京 100142；2.河北省保定市第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 保定 071051；3.安徽省亳州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 亳州 236800)

喉癌手術切緣的傳統(tǒng)研究方法主要是臨床和病理觀察，隨著免疫組化技術及分子生物學的發(fā)展，近年來已達到了細胞和分子水平。細胞周期素D1是重要的細胞周期素蛋白，作為細胞周期的正向調(diào)控因素，其異常表達是導致細胞周期調(diào)控機制受到破壞的主要原因之一，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[1]。有研究[2]表明，細胞周期素D1在正常組織中表達量很少甚至不表達，而在包括頭頸部鱗狀細胞癌在內(nèi)的人體許多惡性腫瘤中存在該蛋白質(zhì)的過度表達。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活因子家族(STATs)于20世紀90年代被發(fā)現(xiàn)，STAT3是其重要成員[3]；但是，STAT3的表達與喉癌患者手術切緣、術后復發(fā)情況以及臨床病理情況的關系卻鮮有報道。本文應用免疫組化技術檢測聲門上喉癌手術切除標本中不同切緣部位喉癌組織的STAT3蛋白表達情況，并對上述問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 2008～2017年收治的手術切緣常規(guī)病理學檢查未發(fā)現(xiàn)癌細胞的聲門上喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)患者82例，其中男性55例、女性27例；年齡39～73歲，中位年齡58.2歲。病例納入標準：符合2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂標準；病例排除標準：術前接受放療、化療等的患者。其中高分化19例、中分化37例、低分化26例；TNM分期：T1期13例、T2期23例、T3期28例、T4期18例。標本取得后立即測量肉眼下距腫瘤最短的切緣距離，將其按2、5、10、25 mm分為4組。將所有標本水平連續(xù)切成5 mm厚的組織片，將最短切緣組織片從切緣向腫瘤邊緣縱向再次連續(xù)切片制成4～5 μm厚的薄組織片用于免疫組化檢測。對照組75例正常喉組織取自同期全喉切除標本的遠端組織，距腫瘤邊緣超過3 cm，病理檢查確認為正常喉黏膜上皮，同樣制成4～5 μm厚的組織片。所有患者術后隨訪3年。本研究通過我院倫理委員會批準通過。

1.2 試劑來源 STAT3兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology(CST)，SP試劑盒購自北京中杉生物技術公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒購自福州邁新生物技術公司。

1.3 方法 采用免疫組化染色SP法。切片脫蠟水化，微波熱修復，過氧化物酶阻斷劑滅活過氧化物酶活性，滴加正常羊血清封閉液，滴加一抗(STAT3兔單克隆抗體)后于4 ℃過夜；滴加生物素標記的二抗37 ℃ 1 h，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶溶液；DAB法顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蘇木素復染2 min。用已知陽性組織切片作陽性對照[4]，用磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對照。

STAT3陽性細胞為細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，高倍鏡下任取5個視野進行計數(shù)，每個視野計數(shù)200個細胞。著色細胞<5%為陰性(-)，5%～29%為弱陽性(+)，30%～49%為中度陽性(++)，≥50%為強陽性(+++)[5]。

所有喉癌患者術后定期復診隨訪，行纖維喉鏡檢查，了解喉內(nèi)情況有無局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移，觀察切緣STAT3表達水平與喉癌術后局部切緣復發(fā)的關系。由于本研究重點在病理學方面，因此隨訪過程中沒有對患者進行增強CT或者增強MRI檢查。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。切緣STAT3陽性表達患者不同切緣長度組間復發(fā)率、切緣STAT3在不同病理資料組間陽性表達率的比較均用χ2檢驗，切緣STAT3表達陰性和陽性2組間生存分析采用對數(shù)秩(Log-rank)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3陽性表達患者不同切緣距離與復發(fā)的關系 82例喉癌組織中STAT3陽性表達68例，陽性率為83%。該68例癌組織STAT3陽性表達者中，24例切緣檢測到STAT3陽性表達。該24例患者中，17例發(fā)生局部復發(fā)，STAT3切緣陽性患者復發(fā)率為70.8%(17/24)， STAT3切緣陰性表達者7例復發(fā)，復發(fā)率為15.9%(7/44)，2組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.315，P<0.05)。2組STAT3表達比較：復發(fā)組STAT3表達強陽性(+++)、中度陽性(++)的構(gòu)成比例明顯高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義(Z=8.216，P<0.05)。

通過對以上數(shù)據(jù)進行Fisher精確概率法兩兩組間比較，結(jié)果顯示，切緣(5 mm處和切緣10 mm處)STAT3的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=2.380，P<0.05)，切緣2 mm處STAT3的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.748，P>0.05)，切緣10 mm處與25 mm處STAT3的陽性表達率差異沒有統(tǒng)計學意義(χ2=5.524，P>0.05；表1)。

表1 STAT3 蛋白在喉癌組織和癌旁不同距離組織中的表達

結(jié)果提示，以切緣 STAT3 陽性表達與否作為輔助評判標準，安全切緣位于距腫瘤邊緣5 mm處。

2.2 切緣 STAT3陽性與陰性表達患者的生存分析 術后隨訪3年，48例STAT3陽性表達患者中失訪5例，包括切緣陽性患者2例、切緣陰性患者3例。隨訪資料完整的15例切緣陽性患者死亡11例，28例切緣陰性患者死亡4例，Kaplan-Meiel生存曲線見圖1。Log-rank檢驗切緣陰性組生存率高于陽性組(Log-rank=6.657，P<0.05)。

2.3 切緣STAT3表達與臨床病理參數(shù)的關系 詳見表2。

圖1. Kaplan-Meiel生存曲線

表2 切緣 STAT3陽性表達與臨床病理參數(shù)的關系(n)

喉癌切緣STAT3陽性表達率在頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.741，P<0.05)。喉癌切緣STAT3陽性表達率在臨床分期T3及T4組顯著高于T1及T2組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.612，P<0.05)，但在T3、T4組與T1、T2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。喉癌切緣STAT3陽性表達率在組織病理高、中、低分化3組間兩兩比較的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

3 討論

喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有逐漸增多趨勢，由于其所處部位為呼吸及發(fā)聲的重要器官，所以對患者危害性極大，手術是目前治療喉癌的主要措施[6]。手術治療一方面需要盡可能地完整切除腫瘤，另一方面也需盡量保留喉功能。因此，原發(fā)病灶的切除范圍即喉癌手術安全切緣問題得到臨床醫(yī)師的重視。目前判斷手術切緣組織是否有腫瘤組織殘留的常規(guī)方法是冷凍或石蠟切片病理診斷，根據(jù)切片中癌細胞殘留與否判斷其是否為安全切緣[7-9]。導致切緣病理假陰性的原因：一方面目前組織病理診斷技術尚不能檢測出少量甚至微量的殘留腫瘤細胞，即微轉(zhuǎn)移灶[10]；另一方面可能存在已出現(xiàn)了分子水平改變的癌前病變細胞，進而導致腫瘤復發(fā)。目前已有很多學者應用免疫組化的方法檢測病理陰性切緣組織的某些蛋白分子的異常表達，并對手術安全切緣進一步定性判斷，已證明P53、ras、c-myc、MMP-2、c-FLIP、RECK、Survivin等多種蛋白在喉癌組織、近癌組織、遠癌組織中的表達差異具有統(tǒng)計學意義[11-13]。

細胞周期素作為細胞周期重要的正性調(diào)節(jié)因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色日益成為關注的焦點，其中STAT3是已被證實與腫瘤有最直接關系的癌基因，其作用機制與Rb蛋白產(chǎn)物(pRb)密切相關。STAT3/CDK4復合物中細胞周期素D1能與pRb結(jié)合使其磷酸化，pRb被磷酸化后釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，后者通過激活基因轉(zhuǎn)錄，促使細胞進入S期。而細胞周期素D1與喉癌的密切關系也已得到很多學者的證實[14]。炎性肝細胞腺瘤(inflammatory hepatocellular adenma，IHCA)是一種良性肝臟腫瘤，以炎性浸潤和急性期嚴重反應過表達為特點。Pilati等的報道顯示，60%的IHCA是通過IL-6家族的細胞因子共受體gp130的體細胞框內(nèi)缺失而激活STAT3。在第46屆歐洲肝臟研究學會(EASL)年會上，Pilati報告了在其余IHCA患者中探索新的STAT3激活機制的研究，結(jié)果顯示人類腫瘤中具有體細胞STAT3突變，人類腫瘤中STAT3激活的這種新機制，可以被Src抑制劑阻斷。同時，研究結(jié)果強調(diào)了Src-STAT3通路作為良性肝腫瘤發(fā)生中關鍵事件的作用。研究者對114例腺瘤的STAT3編碼區(qū)進行測序，對所有識別出的基因突變通過定點誘變進行復制，其功能性影響通過定量RT-PCR和STAT3-報告基因，在肝癌細胞株Hep3B、HepG2或HuH7中進行分析。STAT3磷酸化水平和細胞定位分別通過免疫印跡和免疫熒光分析。為明確STAT3突變激活的機制，研究者進行免疫沉淀分析，并使用RNA干擾和藥理學藥物靶定STAT3的伙伴基因。結(jié)果顯示，12%的非突變gp130 IHCA中可見雜合型體細胞STAT3突變，而在其他HCA亞型中未發(fā)現(xiàn)此突變。這些突變多數(shù)導致SH2區(qū)域的氨基酸替代，該區(qū)域?qū)TAT3的二聚作用很重要。不同于野生型STAT3，所有STAT3突變體可以在無配體情況下激活所有細胞系中的白細胞介素-6(IL-6)信號傳導。而且研究者發(fā)現(xiàn)，突變STAT3的組成性激活需要酪氨酸705的磷酸化和STAT3突變集中在細胞核。此外，在無配體刺激下，STAT3突變體可以形成同源二聚體，其對IL-6暴露高度敏感。使用2種不同的Src抑制劑，可見基線STAT3突變活性有賴于Src酪氨酸激酶。相反，JAK抑制劑和SiRNA分析顯示，在STAT3突變的組成性激活中并不需要gp130和JAK激酶。

STAT3是一種信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子，它通過外界可以直接對相應靶基因進行激活轉(zhuǎn)錄。本實驗檢測聲門上喉癌患者癌旁組織不同距離STAT3蛋白水平的表達，結(jié)果顯示STAT3 蛋白的陽性表達率為 93%，相對于正常組織12%的陽性率，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。喉癌組織的STAT3陽性率明顯高于正常組織，并且由內(nèi)向外遞減[15-16]。相關研究表明，STAT3可以通過編碼凋亡抑制劑以及細胞周期調(diào)節(jié)劑等上調(diào)其基因表達，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展進行干預，很有可能對聲門上喉癌的腫瘤組織診斷、治療提供病理學的靶向指標。采用免疫組化染色SP法，通過對聲門上喉癌的癌組織及癌旁不同距離組織中STAT3 的表達情況進行分析，可以了解到正常喉癌組織中的STAT3顯著表達于喉癌組織和對應的癌旁>20 mm處正常組織[17]。我們應用免疫組化技術檢測喉癌不同切緣長度STAT3表達情況及其與復發(fā)率的關系，進而從分子水平分析喉癌手術切除界限。

本研究所選82例喉癌樣本中有68例癌組織STAT3陽性表達，其手術切緣常規(guī)病理學檢查均未發(fā)現(xiàn)癌細胞即病理切緣陰性，但仍有24例患者復發(fā)，切緣STAT3陽性表達組與切緣STAT3陰性表達組間復發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義，提示STAT3可作為補充病理切緣診斷的分子預警標志。進一步分析，在切緣STAT3陽性表達的患者中，切緣25 mm與10 mm組間復發(fā)率比較的差異有統(tǒng)計學意義，而切緣2 mm與5 mm組間以及切緣10 mm與25 mm組間復發(fā)率比較的差異沒有統(tǒng)計學意義，提示安全切緣位于5 mm處為宜。這與目前被廣泛接受的安全切緣距離相一致[18]。很多學者對喉癌術后患者進行生存分析，結(jié)果均提示手術切緣情況與其預后密切相關。病理切緣陰性和陽性患者的生存率和復發(fā)率明顯不同，陽性患者預后差。

盡管本研究所選病例全部為病理切緣陰性標本，但STAT3的表達情況不同，STAT3陽性表達組和陰性表達組的生存率差異仍具統(tǒng)計學意義(Log-rank=5.83，P<0.05)，說明STAT3可作為喉癌術后預后判斷的重要指標[19]。我們將喉癌患者手術切緣中STAT3的表達情況與臨床病理資料綜合分析發(fā)現(xiàn)，喉癌切緣中STAT3的陽性表達顯著集中在T3、T4期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，說明腫瘤浸潤范圍較廣以及有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，STAT3陽性切緣發(fā)生率增高，這與目前部分學者研究的病理切緣陽性與腫瘤分期及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關系相一致，但STAT3作為分子標志更加敏感。本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)STAT3的表達與組織分化程度存在明顯相關[20-21]。

當然，鑒于本研究樣本量有限，部分結(jié)果尚需進一步擴大樣本量并反復驗證以保證結(jié)果的有效臨床參考意義。雖然喉癌手術方法在不斷改進，但晚期喉癌5年生存率未見明顯改善，將STAT3等分子標志物應用于喉癌的診斷及治療中，有利于更好地評估手術安全切緣及預測腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力，亦為臨床提供更多可能的靶向治療途徑。