環(huán)狀RNA在非瓣膜性心房顫動患者發(fā)病中的作用及機制*

王君 王英 張琪 董海翠 楊吉猛 方旭 史培青 張郁青

心房顫動(簡稱房顫)發(fā)生的電生理機制為折返和異位激動的形成,但潛在的分子機制尚不清楚。在以往的研究中,通常采用心肌組織進行環(huán)狀RNA(circ RNAs)分析,但是心肌組織的獲取不簡單易得。本研究通過采取患者外周血作為樣本,經(jīng)過差異表達分析及定量驗證等過程,來明確circRNAs是否可以作為非瓣膜性房顫的生物標志物,結(jié)合其他纖維化生物標志物的組合分析來預測心肌纖維化的程度。

circ RNAs是非編碼RNA 的其中一個類型,具有封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu),不具有5′和3′端,這使得它們結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不容易受到核糖核酸酶的降解。circ RNAs在表觀遺傳調(diào)控和疾病病原體中發(fā)揮重要作用[1－2]。既往的一些研究利用心臟組織提取circ RNAs,因為心臟組織不簡單易得,為了明確circRNAs是否可以作為房顫的一種新的生物標志物,本實驗利用外周血提取circ RNAs,通過差異表達circ RNAs在內(nèi)源性競爭性RNA(CeRNA)網(wǎng)絡中與相關(guān)基因的關(guān)系,明確circRNAs在非瓣膜性房顫中的作用。

1 資料與方法

1.1 入選人群 從2017年1月到2018年12月,南京市江寧醫(yī)院共有46例患者被納入本實驗。他們被分成兩組:房顫組22例(14例陣發(fā)性房顫,8例持續(xù)性房顫),對照組24 例人群無任何心律失常。所有患者經(jīng)過心電圖(ECG),動態(tài)心電圖(DCG),超聲心動圖(UCG)以及實驗室檢查診斷為房顫或健康對照(根據(jù)2016年ESC房顫管理指南)。納入標準:年齡40～80 歲。患者均完善ECG,DCG,UCG 以及實驗室檢查。排除標準:無腫瘤性疾病以及其他累及免疫系統(tǒng)的疾病,無任何嚴重威脅生命的重大疾病。

1.2 采集血樣 這項研究得到了南京江寧醫(yī)院倫理服務委員會的批準[倫審批第(20180135)號]。所有患者的靜脈血樣均于上午空腹獲得,以1 000 r/min 離心10 min 后分離血清,低溫(－80 ℃)冷凍保存。

1.3 RNA 提取和鑒定 隨機選取房顫組和對照組各3 例,進行circRNAs 定量分析。利用Nano-Drop ND-1000從每個樣本中提取總RNA?；贏rraystar標準協(xié)議進行樣品制備和微陣列雜交。簡單地說,總RNA 被RaseR 酶(Epicentre,Inc.)消化以去除線性RNA 并保留circRNAs。然后,利用隨機啟動方法(Arraystar Super RNAKit;Arraystar)將富集的circ RNAs擴增并轉(zhuǎn)錄成熒光circ RNAs。將標記的circRNAs雜交到Arraystar人circRNAs陣列V2(8x15K,Arraystar)上。隨后,陣列被Agilent掃描儀G2505C 掃描。使用Agilent特征提取軟件(版本11.0.1.1)分析獲得的陣列圖像。使用R 軟件limma包進行量化歸一化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理。兩組間差異表達的circ RNAs通過火山圖過濾鑒定是否具有統(tǒng)計學意義。

1.4 房顫組與對照組circRNAs的差異表達 房顫組與對照組circ RNAs差異表達共發(fā)現(xiàn)6 165 個circRNAs上調(diào),6 744 個circ RNAs下調(diào)。利用R軟件lima包進一步過濾分析,用t 檢驗估計兩組間差異表達的統(tǒng)計學意義。在t 檢驗中P 值小于0.05,差異倍數(shù)大于2 的被認為是差異表達顯著的circRNAs。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR(RT-qPCR)驗證circRNAs

為了進一步驗證在入選患者中circRNAs的差異表達,在22例房顫患者和24例對照者中,篩選出2個上調(diào)的circRNAs和2個下調(diào)的circRNAs。兩組血樣離心,取血清進行RNA 提取。用Nano-Drop ND-1000對每個樣品的總RNA 進行定量。利用基因AMPP CR 系統(tǒng)9700 合成了cDNA。利用Taq Man miRNA 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(RTqPCR)測定候選circRNAs。對46個樣品進行了4個候選circ RNAs的檢測。2個circ RNAs定量與我們之前的差異表達分析結(jié)果一致。

1.6 GO 和KEGG 富集分析 目標基因的差異表達用GO 富集分析模塊(GO:Term Finder,http://search.cpan.org/dist/GO-Term Finder/)評 估 和 確定circRNAs靶基因的差異。用R 功能進行不同circRNAs靶基因的KEGG 富集分析。顯著富集的GO 分析基因和KEGG 通路符合校正后P ＜0.05的標準。

1.7 Circ RNAs和微小RNA(miRNA)相互作用的分析 TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microRNA.org/)可以預測circRNAs與微小RNA(miRNA)的相互作用。通過RT-qPCR 鑒定circRNAs的差異表達,利用上述兩個分析軟件,構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡,對circ RNAs與miRNA 的相互作用進行了詳細分析。

1.8 心肌纖維化相關(guān)生物因子的檢測 利用ELISA 方法測量組織生長因子-β[TGF-β,生工生物工程(上海)股份有限公司,C505060]的水平以及這兩組患者血樣中的Ⅰ型前膠原氨基端前肽(PINP,上?？道噬锟萍加邢薰?貨號:DL-PICP-Hu)、Ⅲ型前膠原氨基端前肽(PⅢNP,上?？道噬锟萍加邢薰?貨號:DL-PⅢCP-Hu)和N 端前腦利鈉肽(NT-proBNP)水平。

1.9 統(tǒng)計分析 計量資料用平均數(shù)±標準差或中位數(shù)表示。采用未配對t 檢驗或Mann-Whitney U檢驗對兩組連續(xù)變量進行比較。多次比較通過方差分析進行評估。用Spearman分析確定不同組間的線性相關(guān)性。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件包(SPSSInc,IBM,美國)進行。

2 結(jié)果

2.1 兩組的基線特征 兩組人群基線特征如表1。兩組患者NT-proBNP含量和左房直徑比較差異有顯著性(P 均＜0.05)。

表1 兩組患者的基線特征

2.2 兩組circ RNAs差異表達的確定 經(jīng)過circ RNAs提取和分析(圖1),根據(jù)差異分析中的P＜0.05以及兩組樣本量中差異circ RNAs表達量(Fold Change,FC)比值大于2,選取P值小且差異表達量比值大的hsa_circRNAs_101216,hsa_circ RNAs_102485作為房顫與對照組之間的上調(diào)表達差異circ RNAs,而hsa_circ RNAs_102158和hsa_circ RNAs_001678作為下調(diào)表達差異circRNAs被挑選進行RT-qPCR 的定量驗證。由于引物設(shè)計困難,2個circRNAs未成功驗證(表2)。hsa_circRNAs_101216(hsa_circ_0006903)和hsa_circ RNAs_001678(hsa_circ_0000517)通過兩組患者中的定量分析,證實為在房顫組中表達上調(diào)和表達下調(diào)。

圖1 不同表達的circRNAs在兩組中的層次聚類

表2 兩組間差異表達的circRNAs

2.3 circRNAs GO 和KEGG 分析的差異表達GO 分析(http://www.geneontology.org)中的基因和基因產(chǎn)物屬性包括三個領(lǐng)域:生物過程、細胞成分和分子功能。

生物過程的富集評分表明,能量代謝、浸潤反應、壞死和凋亡是失調(diào)的circ RNAs調(diào)節(jié)基因的主要生物學功能(圖2)。同時,筆者發(fā)現(xiàn)下調(diào)的circRNAs(hsa_circ_0000517)調(diào)節(jié)基因ME3和TNFRS F19更多地參與能量代謝過程。相反地,上調(diào)的circRNAs(hsa_circ_0006903)調(diào)節(jié)基因PIH1D1、LDHC和TNFRS F19參與調(diào)節(jié)了細胞成分的發(fā)生和發(fā)展。

2.4 Circ RNAs和miRNA 的相互作用 通過ceRNA 的分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000517與hsa-miRNA-671-5p、hsa-miRNA-596,hsa_circ_0006903 與hsamiR-326、hsa-miR-330-5p之間的相互作用(圖3)。

2.5 CircRNAs與心肌纖維化生物標志物的相關(guān)性分析 房顫組的TGF-β、PINP、PⅢNP 和NTProBNP水平均高于對照組;Hsa_circ_0006903 與TGF-β、PⅢNP和PINP呈定量正相關(guān),見表3。

圖2 兩組間差異表達circRNAs的GO 分析生物功能的富集評分

圖3 circRNAs和mRNA 的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡圖

表3 差異表達的circRNAs和心肌纖維化的生物標志物的相關(guān)分析

2.6 circRNAs與患者臨床特征間的相關(guān)性分析綜合分析hsa_circ_0000517,hsa_circ_0006903與患者臨床特征,進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000517與左房直徑成負相關(guān),hsa_circ_0006903與左房直徑成正相關(guān)(表4)。

表4 差異表達的circRNAs和患者臨床特征的相關(guān)分析

3 討論

目前,由于高密度微陣列的推廣應用,許多非編碼RNA 被認為是基因表達的新的和有效的調(diào)節(jié)因子。非編碼RNA 包括miRNAs、INc RNAs、circ RNAs、核糖體RNAs 和核內(nèi)小核糖核蛋白顆粒(snRNPs)以及各種調(diào)節(jié)RNA[3]。其中,circRNAs由于其穩(wěn)定性和保守結(jié)構(gòu),是理想的診斷和治療候選RNA。

本研究試圖確定一種房顫相關(guān)新的生物標志物并研究circ RNAs在非瓣膜性房顫中的發(fā)病機制。房顫組與對照組共鑒定出12909個差異circ RNAs(FC＞2;P＜0.05),包括6165個上調(diào)的circRNAs和6744個下調(diào)的circRNAs。通過RT-qPCR 的方法,筆者驗證了circRNAs定量數(shù)據(jù),選擇了差異表達的環(huán)形RNA(hsa_circ_0000517,hsa_circ_0006903)進行分析。RT-qPCR 結(jié)果表明,RNA 測序鑒定的circRNAs可靠,值得進一步研究。參與房顫患者發(fā)病調(diào)節(jié)的circRNAs可能在房顫進展機制中起關(guān)鍵作用。

目前許多科學家認為,circ RNAs能夠降低心臟成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因的表達水平[2,4]。還有一些學者認為,circRNAs可能涉及離子通道功能的過度修飾,包括鉀通道和細胞內(nèi)鈣離子的處理和釋放[5－6],這些機制可能導致房顫。Raman等[7]發(fā)現(xiàn)適應性基因表達變化可以滿足心臟的代謝需求。他們指出能量代謝在房顫進展中的重要性。代謝分析表明,糖酵解途徑的中間代謝產(chǎn)物,包括2-磷酸甘油酸(2P G)、1,3雙磷酸甘油酸(1,3P G)和丙酮酸的含量較大[8]。在房顫的代謝重塑過程中,葡萄糖代謝增加,脂質(zhì)代謝降低,以維持三羧酸循環(huán)性動脈粥樣硬化[9]。這些結(jié)果與本研究一致。生物過程富集評分表明,調(diào)節(jié)丙酮酸代謝過程是circRNAs調(diào)節(jié)基因的重要功能之一。下調(diào)表達的circ RNAs(hsa_circ_0000517)調(diào)節(jié)基因ME3和TNFRS F19參與了能量代謝浸潤反應的過程,可能導致心肌缺乏能量供應,導致心肌細胞凋亡和壞死,相反地,上調(diào)表達的Circ RNA(hsa_circ_0006903)調(diào)節(jié)基因PIH1D1和LDHC參與細胞生物發(fā)生的降解,可能導致心肌纖維化發(fā)生的加速,這一結(jié)果部分說明了circRNAs在房顫發(fā)病過程中的作用。

在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000517 和hsa_circ_0006903調(diào)節(jié)丙酮酸代謝過程,這表明房顫患者存在能量代謝不足,這可能是hsa_circ_0000517和-0006903之間調(diào)節(jié)平衡的結(jié)果,在這一過程中兩種circRNAs發(fā)揮相反作用,可能加速或減少肌球蛋白細胞的纖維化進展。

心房結(jié)構(gòu)重塑參與房顫的發(fā)展和維持,如左房直徑的形態(tài)變化。NT-proBNP 被證明與陣發(fā)性房顫到持續(xù)性房顫的進展相關(guān),而它也是房顫事件的顯著預測因子[10]。本研究表明,房顫組的NT-proBNP水平高于對照組。說明房顫組患者存在心房結(jié)構(gòu)重塑,這可能是心房心肌的纖維化過程。本研究表明,hsa_circ_0006903與TGF-β、PⅢNP和PINP呈正相關(guān)。而TGF-β、PINP、PⅢNP是心肌纖維化的生物標志物,說明與調(diào)控失調(diào)的circ RNAs水平有一定的關(guān)系。

研究顯示,與心血管疾病相關(guān)的促炎細胞因子和激素,包括腫瘤壞死因子(TNF)-α,IL-6和血管緊張素-Ⅱ[11]。這些細胞因子的釋放也加速了房顫的發(fā)生[12]。對環(huán)狀RNA 的GO 分析表明,環(huán)狀RNA可以介導這些促炎細胞因子的釋放或形成,特別是TNF-α,這也表明circ RNAs參與了房顫的發(fā)展。

每個miRNA 調(diào)控幾十到數(shù)百個不同的靶基因,從而從根本上影響細胞生物學。許多研究已經(jīng)證明了miRNA 參與房顫的發(fā)生和發(fā)展[13－14]。然而,本研究并未發(fā)現(xiàn)這些已知的miRNA 與房顫的關(guān)系。筆者發(fā)現(xiàn),既往研究顯示micro-RNA204-3p調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[15],結(jié)合GO 分析,hsa_circ_0006903 和hsa_circ_0000517 可能通過micro-RNA204-3p調(diào)節(jié)丙酮酸的形成。這一結(jié)果還需要進一步的研究。

但是,本研究仍然有一些局限性,未進行詳細的追蹤隨訪,來觀察這部分患者的各項指標變化。另外,由于不能獲取患者心肌活檢標本,無法對心肌的纖維化程度進行定量的評估。