電感耦合等離子體質(zhì)譜法結(jié)合模式識(shí)別的生/制何首烏無(wú)機(jī)元素差異研究

林艷　夏伯候　李春　廖端芳　林麗美　劉月新

摘要：目的 ?建立生/制何首烏無(wú)機(jī)元素的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析方法，并采用模式識(shí)別對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。方法 ?采用ICP-MS測(cè)定22批不同產(chǎn)地生/制何首烏無(wú)機(jī)元素，并用Simca13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析。結(jié)果 ?22批不同產(chǎn)地生/制何首烏共檢出鎂（Mg）、鉀（K）、鐵（Fe）、釩（V）、鈷（Co）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鍶（Sr）、銣（Rb）、鋇（Ba）、砷（As）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、銅（Cu）14種無(wú)機(jī)元素，其中常量元素以K、Fe、Mg含量較為豐富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量較為豐富。主成分分析不能將生/制何首烏完全分開，正交偏最小二乘-判別分析能將生/制何首烏基本分開;Cu、Cr、Ni、Mg為生/制何首烏最主要的差異性無(wú)機(jī)元素，其中Cu（VIP=2.2）對(duì)生/制何首烏的差異貢獻(xiàn)最大。結(jié)論 ?本研究成功采用ICP-MS從無(wú)機(jī)元素角度區(qū)分了生/制何首烏，可為中藥材質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：電感耦合等離子體質(zhì)譜;生何首烏;制何首烏;無(wú)機(jī)元素;模式識(shí)別;銅

中圖分類號(hào)：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）09-0069-04

Study on Differences of Inorganic Elements Between Crude and Processed Polygonui Multiflori Radix Using ICP-MS and Pattern Recognition

LIN Yan^1，2， XIA Bohou^1，2， LI Chun^2，3， LIAO Duanfang^1，2， LIN Limei^1，2， LIU Yuexin^1，2

1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha 410208， China; 3. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

????Abstract： Objective To study the differences of inorganic elements between crude and processed Polygonui Multiflori Radix?by ICP-MS; To use pattern recognition to identify the two.?Methods The inorganic elements in 22 batches of crude and processed Polygonui Multiflori Radix were determinated by ICP-MS， which were analyzed by PCA and OPLS-DA of Simca13.0 software. Results?There were 14?common inorganic elements in the 22 batches?of crude and processed Polygonui Multiflori Radix， which were Mg， K， Fe， V， Co， Mn， Ni， Sr， Rb，?Ba， As， Pb， Cr and Cu. The contents of K， Fe， and Mg were abundant in the macro element， and Mn， Ni， Sr， Rb，?Ba were abundant in the micro element. These samples could not be completely divided into two categories by PCA， but they could be divided into two categories by OPLS-DA. Cu， Cr， Ni， and Mg were identified as the main different inorganic element， in which Cu （VIP=2.2） was the most different inorganic element. Conclusion The study can successfully identify the crude and processed Polygonui Multiflori Radix by?ICP-MS， and can provide reference?for quality control of TCM.

????Keywords：?ICP-MS; crude Polygonui Multiflori Radix; processed Polygonui Multiflori Radix; inorganic elements; pattern recognition; Cu

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum?Thunb.的干燥塊根。生何首烏苦泄性平兼發(fā)散，具有解毒消癰、潤(rùn)腸通便、截瘧功效;制何首烏味甘厚性溫，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)和強(qiáng)筋骨功效^[1]。藥理研究表明，何首烏具有抗衰老、提高免疫力、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，毒理作用主要表現(xiàn)為肝毒性^[2-3]。何首烏主要含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣質(zhì)等活性成分，另外，何首烏中無(wú)機(jī)元素對(duì)藥效和毒性的影響也不能忽視。無(wú)機(jī)元素測(cè)定方法主要有原子熒光法、原子吸收分光光度法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）等^[4]。ICP-MS具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，已在中藥無(wú)機(jī)元素的分析測(cè)定中推廣^[5-6]。現(xiàn)有的何首烏無(wú)機(jī)元素研究局限于無(wú)機(jī)元素含量的測(cè)定，而對(duì)生/制何首烏所含無(wú)機(jī)元素的差異性研究鮮有報(bào)道。因此，本研究建立不同產(chǎn)地生/制何首烏無(wú)機(jī)元素的ICP-MS檢測(cè)方法，結(jié)合模式識(shí)別對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，為何首烏鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 ?儀器與試藥

Agilent 8800三重四極桿ICP-MS儀（Agilent Technologies），101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），CP114電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司），0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），RT-04A型高速粉碎機(jī)（香港泓荃制藥機(jī)械公司），P60-CW國(guó)之源超純水機(jī)（科爾頓水務(wù)有限公司）。

70%過(guò)氧化氫（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20161103），硝酸（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20171016），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;含有鎂（Mg）、鉀（K）、鐵（Fe）、釩（V）、鈷（Co）、錳（Mn）、鎳（Ni）、鍶（Sr）、銣（Rb）、鋇（Ba）、砷（As）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、銅（Cu）的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，安捷倫科技有限公司;市售22批何首烏飲片均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室龔力民副教授鑒定為蓼科何首烏Polygonum multiflorum?Thunb.的干燥塊根，樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?測(cè)定條件

工作參數(shù)：功率1000 W，冷卻氣流量15.6 L/min，輔助氣流量0.85 L/min，載氣流量0.92 L/min，樣品提升量1.0 L/min，采樣深度10 mm，采樣錐孔徑1.1 mm，截取錐孔徑0.89 mm。

測(cè)量參數(shù)：停留時(shí)間30 ms，重復(fù)次數(shù)3，測(cè)量點(diǎn)/峰3，測(cè)量循環(huán)次數(shù)10，樣品分析時(shí)間70 s/個(gè)，測(cè)量方式為標(biāo)準(zhǔn)曲線法，讀數(shù)方式為峰強(qiáng)。

2.2 ?供試品溶液制備

取樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于聚四氟乙烯消解灌中，加入HNO₃-H₂O₂（4∶1）溶液15 mL，蓋上坩堝蓋，置于通風(fēng)櫥中靜置過(guò)夜，次日于可控溫電熱板上60～80 ℃進(jìn)行濕法消解，加熱至溶液透明澄清，冷卻至室溫，于通風(fēng)櫥揮盡酸，用超純水定容至50 mL，搖勻，即得。

2.3 ?對(duì)照品溶液制備

取一定量10 μg/mL多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1%HNO₃溶液逐級(jí)稀釋，得到多元素濃度分別為0.001、0.004、0.016、0.064、0.256、1.024、4.096 μg/mL的對(duì)照品溶液，用于含量測(cè)定。

2.4 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取14種無(wú)機(jī)元素的系列濃度對(duì)照品溶液，按測(cè)定條件依次測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各元素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 ?加樣回收率試驗(yàn)

取同一批何首烏飲片粉末（S9）樣品6份，每份0.25 g，精密稱定，按樣品中各元素測(cè)定量的100%加入相應(yīng)對(duì)照品，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，各無(wú)機(jī)元素的平均回收率為98.12%～102.45%，RSD均小于1.4%。

2.6 ?樣品含量測(cè)定

取各樣品供試品溶液，按上述條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。22批樣品中常量元素K、Fe、Mg含量較為豐富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量較為豐富。

2.7 ?化學(xué)模式識(shí)別

2.7.1 ?主成分分析

采用主成分分析（PCA）對(duì)22批何首烏樣品建模，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca13.0軟件，以共有無(wú)機(jī)元素含量為自變量，以不同批次何首烏為因變量，進(jìn)行聚類分析。從PCA得分圖（圖1A）可見(jiàn)，此方法不能將22批生/制何首烏完全分開。

2.7.2 ?正交偏最小二乘-判別分析

為了更好建立生/制何首烏無(wú)機(jī)元素的差異模型，運(yùn)用正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）繼續(xù)分析，結(jié)果能將生/制何首烏分成2類（見(jiàn)圖1B）。根據(jù)變量在項(xiàng)目中的重要性（VIP值）篩選差異代謝物，并利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以VIP>1及P<0.05確定差異代謝物，發(fā)現(xiàn)Cu、Cr、Ni、Mg為生/制何首烏最主要的差異性成分，其中Cu（VIP=2.2）對(duì)生/制何首烏的差異性貢獻(xiàn)最大（見(jiàn)圖1C）。

3 ?討論

本試驗(yàn)對(duì)樣品提取溶劑硝酸、高氯酸、硝酸-過(guò)氧化氫（4∶1、2∶1、1∶1）進(jìn)行了詳細(xì)考察，確定了樣品處理方法和ICP-MS條件，在此條件下提取的無(wú)機(jī)元素最多。

本試驗(yàn)采用ICP-MS分析了不同產(chǎn)地22批何首烏樣品中13種無(wú)機(jī)元素。結(jié)果顯示，K、Fe、Mg等常量元素的含量較豐富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量較為豐富。K能加強(qiáng)肌肉的韌性和心臟的運(yùn)動(dòng)力，促進(jìn)蛋白質(zhì)、碳水化合物和熱能代謝，是人體重要的電解質(zhì);Fe參與血紅蛋白、肌紅蛋白及多種含鐵酶的合成，對(duì)免疫系統(tǒng)有一定影響;Mg在蛋白質(zhì)和核酸合成，細(xì)胞氧化磷酸化、細(xì)胞膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)等新陳代謝中有重要作用，還與神經(jīng)和免疫信息傳導(dǎo)有關(guān);Mn是人體必需微量元素，參與多種酶的合成與激活，參與機(jī)體糖、脂肪的代謝，加快蛋白質(zhì)、維生素合成，參與造血過(guò)程，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，提高超氧化物歧化酶活性，提高機(jī)體免疫功能。上述元素所表現(xiàn)出的生理功能與何首烏具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用相一致，說(shuō)明何首烏的無(wú)機(jī)元素是重要的功效物質(zhì)。

重金屬及有害元素是中藥安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定Cu≤20.0 μg/g、Pb≤5.0 μg/g、As≤2.0 μg/g^[7]。本研究測(cè)定的22批何首烏樣品Cu均符合標(biāo)準(zhǔn)，S11、S20的Pb超標(biāo)，S11、S16、S19、S20的As超標(biāo)。為確保臨床用藥安全，重金屬及有害金屬限量控制應(yīng)引起足夠重視。

計(jì)算機(jī)模式識(shí)別技術(shù)是一種有效研究高維空間的手段，能將高維空間的樣本進(jìn)行點(diǎn)分布，利用數(shù)學(xué)模型降維，對(duì)樣本點(diǎn)進(jìn)行比較、判別及預(yù)報(bào)等研究，進(jìn)而討論變量間的關(guān)系。中藥無(wú)機(jī)元素與藥效存在一定關(guān)系，選用合適的元素為特征參量對(duì)各類中藥進(jìn)行識(shí)別，其平均準(zhǔn)確率>85%，可用于中藥分類和道地藥材鑒別^[8]。應(yīng)用模式識(shí)別研究中藥功效和微量元素的關(guān)系，表明無(wú)機(jī)元素含量是中藥功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，每一類藥物中微量元素總體水平相近^[9]。本研究通過(guò)模式識(shí)別分析，建立了生/制何首烏的分類模型，并確定Cu是生/制何首烏中最主要的差異性元素。制何首烏Cu含量明顯高于生何首烏，同時(shí)，制何首烏的抗衰老、增強(qiáng)免疫和抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能明顯強(qiáng)于生何首烏^[10-12]，表明無(wú)機(jī)元素含量與中藥功效有關(guān)。Cu參與微生素合成，為超氧化物歧化酶活性中心，對(duì)機(jī)體新陳代謝起促進(jìn)和協(xié)調(diào)作用，能增強(qiáng)人體免疫功能，提高白細(xì)胞殺菌能力^[13]。Cu參與賴氨酸氧化酶的合成，參與彈性蛋白和膠原蛋白的合成，彈性蛋白和膠原蛋白的質(zhì)和量影響血管系統(tǒng)尤其是大動(dòng)脈管壁的完整性;缺Cu時(shí)，賴氨酸氧化酶作用減弱，彈性蛋白和膠原纖維發(fā)生降解，血管壁內(nèi)膜受損，血管脆性增加、彈性降低，從而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化^[14]。缺Cu會(huì)導(dǎo)致貧血，能量代謝異常，可表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（如銅缺乏綜合征等）;導(dǎo)致毛發(fā)色素脫失，機(jī)體易出血和凝血時(shí)間延長(zhǎng)^[15]。ICP-MS結(jié)合模式識(shí)別可有效地區(qū)分生/制何首烏，可為何首烏的質(zhì)量控制提供新的參考方法，并為中藥質(zhì)量控制提供范例。

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