谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因GSTM1基因多態(tài)性與東北地區(qū)漢族人群肺癌易感性的相關(guān)性及其臨床應(yīng)用創(chuàng)新

王靜　韓彥龍　張書捷　王春濤　鄧代千　孫凱　劉俠　王濤

【摘要】 目的：探究谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因GSTM1基因多態(tài)性與東北地區(qū)漢族人群肺癌易感性的相關(guān)性及其臨床應(yīng)用創(chuàng)新。方法：選取2016年1月-2017年1月本院收治的肺癌患者中408例為研究組，選取同期健康體檢人員303例為對(duì)照組，同組對(duì)象之間不存在血緣關(guān)系。以鹽析法從支氣管肺泡灌洗液或血凝塊殘留液中提取基因組DNA，采用PCR法及基于PCR基礎(chǔ)上的限制性片段多態(tài)檢測(cè)法（PCR-RFLP），對(duì)各基因型進(jìn)行檢驗(yàn)和區(qū)分。采用回顧性“病例-對(duì)照”試驗(yàn)設(shè)計(jì)，危險(xiǎn)度計(jì)算采用非條件性邏輯斯諦回歸模型（Unconditional logistic regression models）分別對(duì)年齡、性別進(jìn)行校正后計(jì)算比數(shù)比（Odds Ratios，OR）及95%可信區(qū)間（Confidential Intervals，CI）。結(jié)果：研究組GSTM1缺陷型基因頻率為0.61，對(duì)照組為0.44，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;GSTM1缺陷型與GSTM1功能型基因相比，缺陷型基因攜帶者患肺癌的危險(xiǎn)升高2.084倍。結(jié)論：GSTM1缺陷型基因是導(dǎo)致東北地區(qū)漢族人群易感肺癌的主要因素，煙草致癌代謝活化是導(dǎo)致癌變的重要途徑。

【關(guān)鍵詞】 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因; 基因多態(tài)性; 東北地區(qū); 漢族人群; 肺癌; 相關(guān)性; 應(yīng)用創(chuàng)新

Association between Glutathione S-transferase Gene GSTM1 Gene Polymorphism and Lung Cancer Susceptibility of Han Population in Northeast China and Its Clinical Application Innovation/WANG Jing，HAN Yanlong，ZHANG Shujie，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：00-004

【Abstract】 Objective：To explore the correlation between glutathione S-transferase gene GSTM1 gene polymorphism and lung cancer susceptibility of Han population in northeast China and its clinical application innovation.Method：A total of 408 lung cancer patients admitted to our hospital from January 2016 to January 2017 were selected as the study group， and 303 health check-ups in the same period were selected as the control group，there was no blood relationship among the subjects in the same group.Genomic DNA was extracted from bronchoalveolar lavage fluid or blood clot residue by salting out method.PCR and PCR-RFLP were used to detect and differentiate the genotypes.Using a retrospective "case-control" trial design，the risk degree was calculated by using unconditional logistic regression models to calculate odds ratios（OR）and 95% confidence intervals（95%CI）after adjusting for age and sex respectively.Result：The frequency of GSTM1-deficient gene in the study group was 0.61，and the control group was 0.44，the difference between two groups was statistically significant（P<0.05）.Compared with GSTM1 functional gene type，GSTM1 deficient gene carriers had a 2.084 times higher risk of lung cancer.

Conclusion：GSTM1 defective gene is the main factor that causes the Han population in northeast China to be susceptible to lung cancer，and the activation of carcinogenesis metabolism in tobacco is an important way to cause cancer.

【Key words】 Glutathione S-transferase gene; Gene polymorphism; Northeastern region; Han population; Lung cancer; Relevance; Applied innovation

First-authors address：School of Basic Medicine，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.001

肺癌作為惡性腫瘤之一，約占各類腫瘤發(fā)病的近20%，其死亡率更是高達(dá)30%。隨著近年來我國(guó)人民生活水平的不斷提高，肺癌的發(fā)生率逐年增加[1]。根據(jù)腫瘤流行病學(xué)研究顯示吸煙與肺癌有密不可分的關(guān)系，習(xí)慣吸煙的人群患肺癌的概率為普通人群的20倍，由此可見吸煙與肺癌之間的關(guān)系密不可分。但是根據(jù)研究結(jié)果顯示并非所有吸煙者均會(huì)患肺癌，這些吸煙者中只有一部分人患有肺癌，這是因?yàn)榉伟┎恢古c煙草有關(guān)，還與個(gè)人對(duì)煙草致癌物的反應(yīng)有關(guān)系，由此可以看出肺癌是由多種因素共同影響作用的，主要有外源性致癌物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)發(fā)生反應(yīng)，DNA堿基發(fā)生缺少或添加導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞的程序凋亡和死亡分化、機(jī)體免疫監(jiān)控。以上均涉及基因多態(tài)的現(xiàn)象，這種成為基因多態(tài)的現(xiàn)象在外源性致癌物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的反應(yīng)和DNA損傷中最為明顯[2]。因?yàn)檎煵葜掳┪镞M(jìn)入人體后會(huì)被相關(guān)酶反應(yīng)代謝清除掉，但是GSTM1基因表達(dá)缺陷將會(huì)干擾此過程的正常進(jìn)行，如果外源性致癌物質(zhì)不能從人體內(nèi)代謝出去，將會(huì)引發(fā)吸煙者發(fā)生肺癌[3]。本文對(duì)該地區(qū)人群進(jìn)行回顧性分析研究，分析GSTM1基因和肺癌癌變的關(guān)系以發(fā)現(xiàn)其在診斷肺癌方面的價(jià)值及臨床創(chuàng)新，選取肺癌患者和不吸煙的健康人群為研究對(duì)象，比較兩種類型的人群體內(nèi)GSTM1基因多態(tài)性的表達(dá)情況。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2017年1月本院收治的肺癌患者中408例為研究組，同時(shí)選取同期健康體檢人員303例為對(duì)照組，同組對(duì)象之間不存在血緣關(guān)系。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)纖維支氣管鏡活檢，為首次確診病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能疾病;其他類神經(jīng)系統(tǒng)病癥;其他惡性腫瘤病史者;近期內(nèi)服用過免疫抑制劑患者;治療期間生活、居住不在本地區(qū)的患者;合并有精神疾病或意識(shí)不清晰不能積極配合。所有研究對(duì)象均知情同意，并且經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 所有研究對(duì)象需要填寫調(diào)查問卷，對(duì)于偏離實(shí)際調(diào)查情況的問卷予以排除，保證所有研究對(duì)象信息完整真實(shí)，包括吸煙史、飲酒史、家族史以及毒物接觸情況[4]。

1.2.1 樣本采集方法 研究組患者在肺癌病變的支氣管口置入纖支鏡，將接近人體正常體溫的生理鹽水50 mL注入后，采用負(fù)壓的方法對(duì)其進(jìn)行吸引，該過程需要重復(fù)兩次，當(dāng)回收的肺支氣管肺泡灌洗液（BALF）含量達(dá)到35%即為合格。通過離心沉淀得到的細(xì)胞成分在同樣條件下進(jìn)行吸引沖洗，離心完成后摒棄上清液，加入Hanks液（生產(chǎn)廠家：北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：H1020）從而制備細(xì)胞懸液，并將制得的細(xì)胞懸液放入EP管中后再置于-70 ℃的低溫下保存[5]。

對(duì)照組患者則抽取血清進(jìn)行臨床檢驗(yàn)，將剩余的血冷凝保存在-70 ℃低溫下即可。

1.2.2 DNA提取方法 將冷凍保存的標(biāo)本取出后予以解凍，并取解凍后的血液1 000 μL置入RP管中，然后加入相同量的Tip頭，通過3 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心，摒棄上清液[6]。該過程需要重復(fù)進(jìn)行多次，當(dāng)血樣標(biāo)本紅色時(shí)證明離心不徹底還需繼續(xù)操作，當(dāng)沉淀的顏色呈淡紅色時(shí)加入200 μL TE懸浮。最后使用70%乙醇吸水干燥。以0.7%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度儀檢測(cè)所提DNA質(zhì)量和濃度，見圖1。

1.2.3 DNA鑒定方法 經(jīng)上述步驟提取的DNA進(jìn)行電泳，并對(duì)凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行觀察，使用100 ng/μL的蒸餾水溶解DNA后持續(xù)震蕩，由此可以制備DNA模板，為下一步的PCR擴(kuò)增做好準(zhǔn)備[7]。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 將生成物離心后置入PCR擴(kuò)增儀，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，將特異性內(nèi)切酶防御恒溫箱中進(jìn)行消化，并通過凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果[8]。

1.2.5 PCR產(chǎn)物分析方法 將制備得到的膠板置入水平電泳槽，使用稀釋的1×TAE液。吸取

2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物之后加樣到瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加樣陰性對(duì)照（未添加DNA模板）及陽(yáng)性對(duì)照（穩(wěn)定PCR產(chǎn)物）[9]。通電之后穩(wěn)壓在100 V，設(shè)定電泳的時(shí)間為10 min。電泳完成之后取出凝膠，在紫外燈下同Marker條帶對(duì)比，從而確定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，使用PCR-RFLP法實(shí)現(xiàn)GSTM1基因分型[10]。GSTM1基因多態(tài)性分析，引物序列：上游 5-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAGC-3，下游 5-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTGG-3;內(nèi)對(duì)照引物（β-globin）：上游 5-CAA CTT CAT CCA CGT TCACC-3，下游 5-GAA GAG CCA AGG ACA GGTAC-3。結(jié)果判斷：GSTM1基因存在，PCR反應(yīng)將包含該重復(fù)序列的片段擴(kuò)增出來，基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為215 bp，β-globin是人白蛋白的基因標(biāo)志，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為268 bp，在凝膠上顯示兩條相應(yīng)大小的亮帶，前方的是GSTM1條帶，后面的是β-globin條帶，記為F型基因;GSTM1基因缺陷，則無215 bp的GSTM1條帶出現(xiàn)，僅有一條268 bp的β-globin條帶，記為D型基因[11]。電泳結(jié)果，見圖2。

1為陰性對(duì)照，M為DNA分子量標(biāo)記。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用

字2檢驗(yàn)。危險(xiǎn)度計(jì)算采用非條件性邏輯斯諦回歸模型（Unconditional logisticregression models）分別對(duì)年齡、性別進(jìn)行校正后計(jì)算比數(shù)比（Odds Ratios，OR）及95%可信區(qū)間（Confidential Intervals，CI）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組研究對(duì)象性別、年齡及吸煙史等資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 兩組GSTM1等位基因和各基因型的分布頻率比較 研究組GSTM1缺陷型基因頻率為0.61，對(duì)照組為0.44，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.291，P=0.029<0.05），見表2。

2.3 兩組GSTM1基因型危險(xiǎn)度分析 GSTM1缺陷型與GSTM1功能型基因相比，缺陷型基因攜帶者患肺癌的危險(xiǎn)升高2.084倍，見表3。

3 討論

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶屬于催化酶，可以催化親電子物質(zhì)和GSH結(jié)合達(dá)到消毒DNA毒性的效果，而且兩者結(jié)合生成的產(chǎn)物可以溶于水[12]。因此谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶可以避免細(xì)胞受到促癌因素的影響，將機(jī)體內(nèi)的微粒體過氧化過程阻斷，并且對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)[13]。但是肺癌患者體內(nèi)的GSTM1基因表達(dá)缺陷，與正常的基因不同，不能產(chǎn)生行使該功能的酶，因而無法阻斷微粒體過氧化，也不能對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，從而使肺癌的易感性增加[14]。

基因多態(tài)是指一個(gè)基因位點(diǎn)存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因，它們之間成為等位基因。產(chǎn)生等位基因的原因有多種，主要包括單個(gè)堿基改變，DNA片段的插入或缺失，重復(fù)或序列發(fā)生變化，而且等位基因具有較高的發(fā)生頻率，它們會(huì)影響基因產(chǎn)物的表達(dá)從而導(dǎo)致與肺癌之間的關(guān)聯(lián)[15]。

煙草煙霧中的致癌物多達(dá)55種，最主要的是多環(huán)芳烴類和亞硝胺類，這些前致癌物進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)代謝活化酶活化后成為致癌物，進(jìn)一步生成DNA加成產(chǎn)物導(dǎo)致DNA損傷;另一方面活化生成的致癌物還可通過代謝解毒酶降解排出[16-17]。兩種酶的共同作用在個(gè)體間存在差異，由此導(dǎo)致個(gè)體腫瘤易感性的差異。因此致癌物能否引起個(gè)體癌變主要取決于兩種酶之間的作用大小，由于編碼該種酶基因的特性是遺傳多樣性，因此基因變異時(shí)會(huì)對(duì)酶造成影響，比如酶的功能、活性等，進(jìn)一步影響酶激活或滅活目標(biāo)底物的能力[18]。

而且肺癌在早期是不易被診斷出來的，當(dāng)患者自身有所發(fā)現(xiàn)再檢查時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過最佳手術(shù)機(jī)會(huì)，但是根據(jù)大量的研究結(jié)果顯示肺癌患者的治療效果與基因變異之間存在一定聯(lián)系，所以借助于生物標(biāo)志物來對(duì)肺癌患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，這在一定程度上也是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在臨床上的應(yīng)用創(chuàng)新[19]。

本文采用研究組與對(duì)照組的對(duì)比研究，不過兩組研究對(duì)象均來自本院，受種族、地域、樣本數(shù)量、環(huán)境以及個(gè)體差異等方面因素的影響，本研究只針對(duì)GSTM1、家族史、吸煙史等危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，存在一定的局限性。這是因?yàn)槎鄠€(gè)危險(xiǎn)因素彼此之間可能會(huì)發(fā)生相互影響，從而生成不同的效果，所以GSTM1的基因多態(tài)性同肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然需要深入研究[20]。研究組GSTM1缺陷型基因頻率為0.61，對(duì)照組為0.44，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;GSTM1缺陷型與GSTM1功能型基因相比，缺陷型基因攜帶者患肺癌的危險(xiǎn)升高2.084倍。

綜上所述，GSTM1基因型在肺癌的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，且GSTM1的基因多態(tài)性是肺癌風(fēng)險(xiǎn)因素。這就需要后續(xù)進(jìn)行多位點(diǎn)、大樣本研究，從而得到科學(xué)結(jié)果，從而為肺癌患者的早診斷、早治療提供可靠的依據(jù)。

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