淺談離體血管環(huán)實驗

程香 孫霞 劉英光

【摘 要】2016年，中國心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病。腦血管病、冠心病、外周動脈疾病等血管性疾病在心血管病中占據(jù)著重要地位。離體血管環(huán)實驗是研究血管舒縮功能的一種實驗方法。通過對血管舒縮功能研究，探討血管疾病的本質，從而為心血管疾病的防治提供科學依據(jù)。本文從離體血管環(huán)實驗簡介、實驗設備、實驗步驟及實驗中的經驗總結等方面進行闡述，希望對即將開展該實驗的研究人員提供一些幫助。

【關鍵詞】離體血管環(huán)實驗;血管功能;收縮;舒張

中圖分類號： TH776.2 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）23-0220-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.23.104

【Abstract】In China， Cardiovascular Disease（CVD） was the leading cause of death in 2016， more than tumors or any other diseases.Cerebrovascular disease， coronary heart disease， and peripheral arterial disease occupy an important position in cardiovascular disease.The vascular ring experiment in vitro is an experimental method for the study of vasomotor contraction and relaxation.Through the study of vasomotor function， the nature of vascular diseases is explored to provide a scientific basis for the prevention and treatment of cardiovascular diseases. This article describes the introduction， devices， procedures and experience of the vascular ring experiment in vitro， hoping to provide some helps for researchers to conduct the experiment.

【Key words】The vascular ring experiment in vitro; Vascular function; Contraction; Relaxation

心血管系統(tǒng)疾病是世界范圍內死亡的主要原因，但其發(fā)病機制尚不清楚[1]。調查顯示，2016年，中國心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構成的40%以上。腦血管病、冠心病、肺血管病及外周動脈疾病等血管性疾病在心血管病占據(jù)著重要地位[2]。離體血管環(huán)實驗是研究血管舒縮功能的一種實驗方法，是研究血管生理學、病理生理學和藥理學的重要手段[3]。通過對血管舒縮功能研究，探討血管疾病的本質，從而為心血管疾病的防治提供科學依據(jù)。本文第一作者有幸作為“2018年中西部高等學校青年骨干教師國內訪問學者”，于2018年9月到西安交通大學醫(yī)學部生理學與病理生理學系進行為期10個月的訪問學習，期間跟隨心血管病理生理學研究團隊，參與了大鼠、小鼠離體血管環(huán)實驗，現(xiàn)就該實驗基本內容、實驗設備與器材、實驗步驟及注意事項和在該實驗中的經驗等闡述如下。

1 離體血管環(huán)實驗簡介

離體血管環(huán)實驗是研究血管舒縮功能的一種實驗方法。實驗裝置不斷推陳出新，目前使用較廣泛的是DMT620多通道離體微血管張力測定系統(tǒng)（丹麥）（圖1）。首先分離血管，清除周圍結締組織和脂肪組織，切成2-3mm長的血管環(huán)，再用金屬絲或鎢絲穿過血管環(huán)并懸掛于張力浴槽內，連接張力換能器和計算機，測定并記錄離體血管的舒縮活動，常用于研究大鼠腸系膜動脈[4]、大鼠腦基底動脈[5]、小鼠腸系膜動脈[6]、小鼠主動脈、髂動脈、頸動脈、腎動脈[7]等微小血管的功能。

2 離體血管環(huán)實驗設備、器材

離體血管環(huán)實驗所需設備、器材包括：（1）動物解剖臺;（2）手術解剖顯微鏡;（3）DMT620多通道離體微血管張力測定系統(tǒng);（4）氧氣瓶;（5）微型真空泵;（6）培養(yǎng)皿;（7）水浴鍋;（8）常用動物手術器械;（9）移液器等。

3 離體血管環(huán)實驗步驟及操作注意事項

（1）打開儀器設備，檢查儀器狀態(tài)。

（2）在DMT620多通道離體微血管張力測定系統(tǒng)張力浴槽內填充5ml預冷的（4℃）Krebs-Henseleit溶液（KHS），KHS成分（濃度/mM）：NaCl115，NaHCO325，KCl 4.6，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl22.5，Glucose.H2O10，充95%O2+5%CO2后用NaOH調至pH7.4[8]。注意此時不可加熱。

（3）處死動物，解剖并分離組織，輕輕取出擬研究的血管組織，放置于含預冷的（4℃）KHS的容器中，稍微沖洗血管表面及管腔內部分血液。

（4）將血管組織轉移至含預冷的（4℃）KHS的專用培養(yǎng)皿中，輕輕撐開血管并分離血管表面的脂肪及結締組織等，盡量分離干凈。

（5）剪切一段長約2mm的血管環(huán)，建議取中間段的或分支，兩端的不要。

（6）將一根血管環(huán)轉移至一個張力浴槽中。用金屬絲（40μm）或鎢絲（25μm）穿過血管環(huán)固定于張力浴槽內。

（7）血管環(huán)固定好后檢查兩根絲的位置，調至平行狀態(tài)，血管環(huán)處于松弛狀態(tài)，不受力。

（8）將固定有血管環(huán)的張力浴槽放置于主控制器面板上，插上傳感器連接線。

（9）打開通氣，使氣泡一個接一個冒出，打開加熱，升溫至37℃。

（10）待溫度上升至37℃后，拉至初始預張力。小鼠胸主動脈約5mN，大鼠腸系膜動脈約3mN。在此基礎上，可根據(jù)血管粗細適當調整。

（11）更換5mL 37℃預熱通氣的KHS，開始平衡，平衡過程中每隔20min換一次張力浴槽內的溶液。平衡總計60min。在平衡過程中，每隔5min左右旋轉螺旋尺調節(jié)初始值，使張力始終維持在最佳初始值附近即可。

（12）打開電腦軟件，開始記錄。

（13）調零（Zero）。排空浴槽中的KHS。排空后，立即加入5ml 60mM的高鉀Krebs-Henseleit溶液刺激血管并添加注釋，刺激到上升至平臺期。60mM的高鉀KHS成分（濃度/mM）：NaCl63.7，NaHCO315，KCl60，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl21.5，Glucose.H2O 5.5，充95% O2+5%CO2后用NaOH調至pH7.4。

（14）使用37℃預熱充氣的KHS洗脫至基線。等待10min后再進行刺激。

（15）排空浴槽中的KHS。立即加入5ml 60mM的高鉀KHS第二次刺激并添加注釋，刺激到上升至平臺期。按上一步驟的方法洗脫血管至基線。

（16）等待15min，添加1μM（5μL 1×10-3M至5mLKHS）收縮劑（去甲腎上腺素或苯腎上腺素），刺激至平臺期，并維持在平臺。

（17）添加乙酰膽堿10μM（5μL 1×10-2M至5mLKHS）。舒張2min。觀察血管舒張程度，血管能夠舒張至85%以上，表明血管內皮功能完好。

（18）如果需要做量效曲線，可以直接加收縮藥，逐漸增加乙酰膽堿或其他舒張藥的濃度，觀察舒張曲線。

（19）用37℃預熱充氣的KHS洗脫血管3次，每次15min。

（20）根據(jù)實驗設計，用藥物孵育血管（15min）或不孵育，添加收縮劑，待收縮至平臺期，濃度累積地加入不同的舒張藥，觀察舒張曲線。每組藥物之間均按上一步驟的方法洗脫血管。

（21）結束實驗，保存文件。

（22）清洗儀器。

4 離體血管環(huán)實驗的體會

離體血管環(huán)實驗比較耗時，從分離血管到實驗結束，少則4-5h，多可達10h以上，非?？简瀸嶒炄藛T的耐心。通過幾個月的實驗操作，現(xiàn)將實驗過程中的經驗總結如下，希望對今后開展此實驗的研究人員提供一些幫助。

1）在分離血管時，一定要有耐心，切勿過度牽拉血管，否則易使血管失去活性。分離血管是一項技術活，要想得到活性好的血管，一定要多練，可以先分離直徑較粗的胸主動脈，再過渡到腸系膜2級或3級血管。血管離體后，不能干燥，必須放置于盛有KHS的容器內。

2）血管分離后，將血管固定于張力浴槽時，注意勿損傷血管內皮，我們的經驗是先穿過一根絲，固定到張力浴槽上，再穿第二根絲并固定。在穿第二根絲時，務必與第一根絲平行，不能有交叉。固定好后，要使血管處于松弛狀態(tài)，不受力。

3）血管固定好后，調至初始預張力后平衡血管也是非常重要的過程，此過程使血管逐步適應離體環(huán)境，為后續(xù)血管功能測定奠定基礎，若血管未平衡好，在加藥時，血管會對藥物的反應性差，影響實驗順利進行。因此，在調初始張力時，為了使血管逐漸適應，我們常常逐步升高張力，如初始張力為3mN，先調至0.5mN，穩(wěn)定數(shù)分鐘，再增加至1mN，穩(wěn)定數(shù)分鐘，直至到3mN。

4）加藥時，合理掌握加藥時間是極為重要的。（1）在加入收縮劑后，一定要達到收縮平臺期后才能加舒張藥，否則可能出現(xiàn)加入舒張藥后，張力還繼續(xù)升高的情況，無法分析到底是收縮劑還是舒張藥的作用。（2）不同的血管，加藥時間、間隔不能一概而論，實驗中我們發(fā)現(xiàn)，加入相同濃度的苯腎上腺素，小鼠腸系膜動脈達到收縮平臺期時間明顯短于小鼠胸主動脈，故加藥時間應相應縮短。（3）即使是相同類型的血管，由于不同浴槽內血管的反應性不同，也應認真觀察，合理掌握加藥時間，同為小鼠胸主動脈，同時加入相同濃度的苯腎上腺素后，如第一個浴槽內血管最先到達收縮平臺期，則應先加舒張藥至此浴槽，以此類推。

5）有時，血管張力曲線不穩(wěn)定，要注意分析原因。如第一次加收縮藥時，血管收縮不理想，可能血管未平衡好，還未較好地適應離體環(huán)境，可用37℃預熱充氣的KHS洗脫血管后，再平衡一段時間。

總之，做離體血管環(huán)實驗是一個非常艱辛的過程，不僅要敢吃苦，還要善于開動腦筋，總結經驗，合理優(yōu)化實驗設計，實驗過程中要耐得住性子，合理掌握加藥時間，使實驗結果更能客觀反映血管本身的狀態(tài)及功能。

【參考文獻】

[1]Zhang L，Wang Y，Li Y et al，Hydrogen Sulfide（H2S）-Releasing Compounds：Therapeutic Potential in Cardiovascular Diseases[J].Front.Pharmacol.9：1066.doi：10.3389/fphar.2018.01066.

[2]胡盛壽，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報告 2018》概要（R），中國循環(huán)雜志 2019 年 3 月 第 34 卷 第 3 期（總第 249 期）.

[3]介紹一種離體血管環(huán)的實驗裝置和方法[J].劉沙、蕭明第、薛松、盧成寶，《醫(yī)學研究生學報》，2002 年6月，第15卷 第3期，199-203.

[4]Wang XF， Cheang WS， Yang HX et al， Nuciferine relaxes rat mesenteric arteries through endothelium-dependent and-independent mechanisms[M]，British Journal of Pharmacology， （2015） 172 5609-5618.

[5]Yu Wei， Wang Yan， Song Zheng， Zhao Li-Mei， Li Gui-Rong， Deng Xiu-Ling.Equol increases cerebral blood flow in rats via activation of large-conductance Ca2+-activated K+ channels in vascular smooth muscle cells[M]，Pharmacological Research， http：//dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2016.03.015.

[6]Yang GD，Wu LY，Jiang B et al，H2S as a Physiologic Vasorelaxant： Hypertension in Mice with Deletion of Cystathionine γ-Lyase[M].Science.2008 October 24; 322（5901）： 587–590. doi：10.1126/science.1162667.

[7]Oliver BARETELLA， Sookja K CHUNG， Aimin XU et al，Endothelial overexpression of endothelin-1 modulates aortic， carotid， iliac and renal arterial responses in obese mice[M].Acta Pharmacologica Sinica （2017） 38： 498–512.

[8]Wang Y，Sun HY，Liu YG et al，Tyrphostin AG556 increases the activity of large conductance Ca2+-activated K+ channels by inhibiting epidermal growth factor receptor tyrosine kinase[M].J. Cell. Mol. Med. Vol 21， No 9， 2017 pp. 1826-1834.