• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同劑量下腹腔注射人臍帶間充質干細胞對治療2型糖尿病大鼠的有效性研究

    2019-09-28 13:39:53李翰宇連曉芬孫天慧楊旸盧東暉張帆
    中國實用醫(yī)藥 2019年24期
    關鍵詞:胰島空腹胰腺

    李翰宇 連曉芬 孫天慧 楊旸 盧東暉 張帆

    【摘要】 目的 評估腹腔注射不同劑量人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)對2型糖尿病(T2DM)大鼠治療的有效性。方法 選取18只5~6周齡雄性SD大鼠, 隨機選擇3只分入組1, 予以正常飲食喂養(yǎng);剩余15只予以高脂飲食喂養(yǎng)。8周后, 予15只大鼠按50 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)1次, 注射STZ 1周后測空腹血糖, 達到組1的3倍則認為造模成功。將造模成功的9只大鼠隨機分為組2、組3和組4, 每組3只。組3和組4立即腹腔注射1次hUC-MSCs, 注射細胞量為2×106/kg, 組2進行腹腔注射等量磷酸鹽緩沖液(PBS);1周后, 組4再次予以注射同等劑量hUC-MSCs, 測hUC-MSCs治療2周后大鼠的空腹血糖、空腹胰島素, 并行腹腔注射葡萄糖耐受試驗(IPGTT), 比較分析四組大鼠血糖水平、胰島素水平變化情況。治療4周后, 留取四組大鼠胰腺組織行蘇木精 — 伊紅染色法(HE)染色和免疫組化, 并進行分析。結果 hUC-MSCs移植2周后, 四組的空腹血糖和HOMA-β水平組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組2的空腹胰島素(21.68±3.87)μIU/ml低于組1的(29.33±4.39)μIU/ml和組4的(28.95±2.41)μIU/ml, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組1的HOMA-IR低于組2和組3, 組2的HOMA-IR高于組3和組4, 組3的HOMA-IR高于組4, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組1的HOMA-IS高于組2和組3, 組2的HOMA-IS低于組3和組4, 組3的HOMA-IS低于組4, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。hUC-MSCs移植后, 組3和組4的血糖水平均逐漸下降, 組4下降更明顯, 但與組1比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);IPGTT中, 組3和組4血糖高峰均在30 min出現(xiàn), 與組1曲線特征相符合, 且組4更接近組1水平。hUC-MSCs注射后4周后取大鼠胰腺組織顯微鏡下觀察, 組1大鼠胰腺組織形態(tài)完整, 胰島內細胞排列整齊, 細胞界限清楚, 胰島密度正常;組2大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則, 細胞排列紊亂, 胰島數(shù)目減少;而組3和組4較組2有不同程度改善, 組4組織形態(tài)較組3胰腺組織形態(tài)完整, 細胞排列整齊。使用胰島抗體免疫組化染色后可見, 組2大鼠胰島細胞非常少, 組4組織形態(tài)較組3胰島內胰島細胞數(shù)目增多, 但較組1大鼠胰島細胞少。結論 經(jīng)腹腔途徑注射hUC-MSCs可以有效的治療T2DM大鼠, 且高劑量可以更好的修復胰腺組織, 改善β細胞功能, 增加β細胞數(shù)目, 改善胰島素抵抗。

    【關鍵詞】 2型糖尿病;人臍帶間充質干細胞;腹腔注射; 劑量;有效性

    DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.108

    Study on effectiveness of intraperitoneal injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different doses in type 2 diabetes mellitus? rats? ?LI Han-yu, LIAN Xiao-fen, SUN Tian-hui, et al. Anhui Medical University, Hefei 230032, China

    【Abstract】 Objective? ?To evaluate the effectiveness of intraperitoneal injection of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) at different doses in type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats. Methods? A total of 18 male SD rats aged 5-6 weeks were selected. 3 rats were taken as group 1 and fed with normal diet, and the remaining 15 rats were fed with high-fat diet. 8 weeks later, 15 rats were intraperitoneally injected with streptozotocin (STZ) at a dose of 50 mg/kg once Fasting blood glucose was measured 1 week later, and 3 times of group 1 was considered to be successful. 9 rats with successful modeling were randomly divided into group 2, group 3 and group 4, with 3 rats in each group. Group 3 and group 4 were intraperitoneally injected with hUC-MSCs once immediately by 2×106/kg. Group 2 was intraperitoneally injected with the same dose of phosphate buffered saline (PBS). 1 week later, group 4 was injected with the same dose of hUC-MSCs again. Fasting blood glucose and insulin were measured after 2 weeks of treatment. The changes of blood glucose and insulin levels were compared and analyzed by intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT). After 4 weeks of treatment, the pancreatic tissues of rats in four groups were taken for hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemistry. Results? 2 weeks after hUC-MSCs transplantation, there was statistically significant differences in fasting blood glucose and HOMA-β levels among the four groups (P<0.05). Group 2 had lower fasting insulin as (21.68±3.87) μIU/ml than (29.33±4.39) μIU/ml in group 1 and (28.95±2.41) μIU/ml in group 4, and their difference was statistically significant (P<0.05). HOMA-IR in group 1 was lower than those in group 2 and group 3, HOMA-IR in group 2 was higher than those in group 3 and group 4, HOMA-IR in group 3 was higher than that in group 4. Their difference was statistically significant (P<0.05). HOMA-IS in group 1 was higher than those in group 2 and group 3, HOMA-IS in group 2 was lower than those in group 3 and group 4, and HOMA-IS in group 3 was lower than that in group 4. Their difference was statistically significant (P<0.05). After hUC-MSCs transplantation, the blood glucose levels of group 3 and group 4 gradually decreased, and that of group 4 decreased more significantly, but the difference was statistically significant compared with group 1 (P<0.01). In IPGTT, the blood glucose peaks of group 3 and group 4 appeared at 30 min, which was consistent with the curve characteristics of group 1, and group 4 was closer to the level of group 1. 4 weeks after hUC-MSCs injection, the pancreatic tissue of the rats was observed under microscope. The pancreatic tissue of group 1 was intact, the cells in the islets were arranged neatly, the cell boundaries were clear, and the islet density was normal. The islets of group 2 were irregular in shape, the cells were arranged disorderly, and the number of islets was decreased. Group 3 and group 4 were improved to different extents compared with group 2, and the morphology of group 4 was more complete than that of group 3, and the cells were arranged neatly. After immunohistochemical staining with islet antibody, there were very few islet cells in group 2, and the number of islet cells in group 4 was higher than that in group 3, but less than that in group 1. Conclusion? Intraperitoneal injection of hUC-MSCs is effective in the treatment of T2DM rats. High dose of injection can better repair pancreatic tissue, improve the function of beta cells, increase the number of beta cells, and improve insulin resistance.

    【Key words】 Type 2 diabetes mellitus; Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Intraperitoneal injection; Dose; Effectiveness

    糖尿病是一類伴有不同程度胰島素分泌缺乏或胰島功能障礙的代謝性疾病, 2017年全球患病率為8.8%, 中國患病率為10.9%[1]。面對這如此龐大的患患者群, 現(xiàn)有的治療手段卻無法根治。根治糖尿病的關鍵就在于修復胰腺β細胞的功能。干細胞具有強大的分化潛能, 為修復胰腺提供了可能性。本研究擬用腹腔注射人臍帶間充質干細胞(human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells, hUC-MSCs)途徑, 探索hUC-MSCs對修復2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠胰腺功能的有效性, 為臨床干細胞治療T2DM患者提供基礎科研依據(jù), 為T2DM患者尋求新的有效的臨床治療方法?,F(xiàn)報告如下。

    1x 材料與方法

    1. 1 材料及主要試劑 選取雄性SD大鼠(5~6周齡)18只, 平均體重180~200 g, 購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心, 許可證號:SCXK(粵)2013-0002。人臍帶來源間充質干細胞(P5-P6代細胞)由深圳市北科生物科技有限公司提供。

    1. 2 研究方法

    1. 2. 1 動物模型建立 在購入的18只5~6周齡的雄性SD大鼠中隨機取15只作為造模組, 剩余3只作為對照組。①造

    模組:高脂飼料飼喂8周, 8周后, 按50 mg/kg的劑量予以腹腔內注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 1次, 注射STZ 1周

    后, 測大鼠體重、空腹血糖和空腹胰島素水平。②對照組:正常飼料飼養(yǎng)8周, 8周后, 予以腹腔內注射等劑量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS) 1次, 注射PBS 1周后, 測大鼠體重、空腹血糖和空腹胰島素。造模成功檢驗方法:STZ注射1周后, 測所有大鼠體重、空腹血糖和空腹胰島素, 取鼠尾血樣前, 大鼠禁食過夜至少6 h, 造模組大鼠空腹血糖水平超過對照組3倍以上認為造模成功。造模結果:造模組15只SD大鼠, 經(jīng)檢驗后, 成功9只, 失敗6只, 造模成功率為60%, 無死亡。

    1. 2. 2 干細胞治療方法 實驗分為4組, 將3只對照組SD大鼠分配至組1, 將9只造模成功的T2DM大鼠隨機分配至組2、組3和組4, 每組3只。造模檢驗成功后, 立即予以組3和組4的T2DM大鼠經(jīng)腹腔注射hUC-MSCs, 劑量為2×106/kg;組2予以等劑量的PBS腹腔注射, 組1不予以任何處理;1周后, 再次予以組4大鼠腹腔注射劑量為2×106/kg 的hUC-MSCs,?組1、組2、組3不予以任何處理。組2、組3和組4予以高脂飼料喂養(yǎng), 組1予以正常飼料喂養(yǎng)。

    1. 3 觀察指標

    1. 3. 1 有效性指標 hUC-MSCs治療2周后行腹腔注射葡萄糖耐受試驗(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)。進行IPGTT之前, 大鼠禁食過夜至少6 h, 腹膜內注射葡萄糖(2.0 g/kg)。注射后0、30、60、90和120 min, 取鼠尾血樣, 測定血糖和空腹胰島素水平。

    1. 3. 2 形態(tài)學和免疫組化 hUC-MSCs注射4周后, 過量麻醉法處死動物, 手術切除T2DM大鼠胰腺組織。4%多聚甲醛固定48 h, 常規(guī)石蠟包埋石蠟切片, 行HE染色, 并用胰島素抗體進行胰島免疫組化檢測, 光鏡下觀察胰島結構與α細胞、β細胞的分布情況。

    1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗, 組間比較采用單因素方差分析+兩兩比較LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2. 1 大鼠hUC-MSCs移植2周后血糖、胰島素及β細胞功能比較 hUC-MSCs移植2周后, 四組的空腹血糖和HOMA-β水平組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組2的空腹胰島素(21.68±3.87)μIU/ml低于組1的(29.33±4.39)μIU/ml和組4的(28.95±2.41)μIU/ml, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組1的HOMA-IR低于組2和組3, 組2的HOMA-IR高于組3和組4, 組3的HOMA-IR高于組4, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組1的HOMA-IS高于組2和組3, 組2的HOMA-IS低于組3和組4, 組3的HOMA-IS低于組4, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。hUC-MSCs移植后, 組3和組4的血糖水平均逐漸下降, 組4下降更明顯, 但與組1比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);IPGTT中, 組3和組4血糖高峰均在30 min出現(xiàn), 與組1曲線特征相符合, 且組4更接近組1水平。見圖1。

    2. 2 四組大鼠hUC-MSCs移植4周后胰腺組織HE染色及胰島抗體免疫組化染色分析 hUC-MSCs注射后4周后取大鼠胰腺組織顯微鏡下觀察, 組1大鼠胰腺組織形態(tài)完整, 胰島內細胞排列整齊, 細胞界限清楚, 胰島密度正常;組2大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則, 細胞排列紊亂, 胰島數(shù)目減少;而組3和組4較組2有不同程度改善, 組4組織形態(tài)較組3胰腺組織形態(tài)完整, 細胞排列整齊。見圖2。使用胰島抗體免疫組化染色后可見, 組2大鼠胰島細胞非常少, 組4組織形態(tài)較組3胰島內胰島細胞數(shù)目增多, 但較組1大鼠胰島細胞少。見圖3。

    3 討論

    目前雖然已有關于hUC-MSCs有效性的相關研究[2-4], 但是移植劑量沒有統(tǒng)一的標準。為探尋β細胞修復程度與移植劑量的關系, 本實驗設置了高低劑量組。關于輸注途徑, 對于動物實驗而言, 動脈輸注、胰腺包膜下注射和腎包膜下注射均需要手術, 創(chuàng)傷大, 會增加感染及死亡風險, 靜脈輸注相比腹腔注射途徑治療效果更優(yōu), 但操作難度相對較大, 雖然有實驗[5, 6]顯示腹腔注射途徑效果不明顯, 但是不排除與選擇的干細胞種類、輸注劑量和輸注的模式有關, 故本實驗擬采用腹腔注射途徑, 去驗證該途徑的有效性。

    hUC-MSCs治療2周后, 接受干細胞治療的大鼠血糖均較未接受干細胞治療的T2DM大鼠下降明顯, 且高劑量組的大鼠血糖下降更明顯, 該結果提示干細胞治療可以降血糖, 這與其他實驗結果相符合[2-4]。目前, 干細胞治療糖尿病的確切機制仍不明確, 從已有的研究中, 大家普遍認為主要有三大機制:①改善胰島β細胞功能[2, 7-9];②改善外周組織胰島素抵抗[10];③抗炎和免疫調節(jié)作用[11, 12]。在本實驗中, 治療后大鼠HOMA-β及空腹胰島素水平明顯升高, 且對于HOMA-β而言, 高劑量的效果更佳, 結合IPGTT、細胞學和免疫組化結果, 治療后大鼠的胰腺形態(tài)得到了改善, 且胰島細胞數(shù)目增多, 提示干細胞治療不僅可以改善β細胞功能, 而且可以增加β細胞的數(shù)量, 這與其他實驗相符合[7-9]。

    但β細胞數(shù)目的增加是由于胰島細胞的相互轉化[13], 還是自身的再生[7-9], 亦或是凋亡的減少[2], 本實驗尚不能說明。干細胞治療后, HOMA-IS和HOMA-IR改善明顯, 結合IPGTT結果, 治療后的大鼠血糖曲線特征已符合正常大鼠的曲線特征, 且高劑量組更貼近正常組, 提示外周組織對胰島素的反應性升高, 干細胞改善了外周胰島素抵抗, 這與其他實驗[2]相符合??赡芘c胰島素靶組織中胰島素受體底物-1, 也可能與改善體內代謝應激和全身慢性反應有關[14]。

    綜上所述, 經(jīng)腹腔途徑注射hUC-MSCs可以有效的治療T2DM大鼠, 該途徑有效;且高劑量的干細胞治療, 可以更好的修復胰腺組織, 改善β細胞功能, 增加β細胞數(shù)目, 改善胰島素抵抗。

    參考文獻

    [1] Cho N H, Shaw J E, Karuranga S, et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research & Clinical Practice, 2018(138):271.

    [2] Xie Z, Hao H, Tong C, et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells elicit macrophages into an anti-inflammatory phenotype to alleviate insulin resistance in type 2 diabetic rats. Stem Cells, 2016, 34(3):627-639.

    [3] 阮光萍, 劉菊芬, 李自安, 等. 人臍帶間充質干細胞對獼猴糖尿病治療效果的研究. 中華細胞與干細胞雜志(電子版), 2017, 7(3):131.

    [4] 董松, 王鴻, 雷蕾, 等. 人臍帶間充質干細胞經(jīng)動脈介入治療2型糖尿病Beagle犬的作用. 中國醫(yī)藥導報, 2017, 14(22):16-20.

    [5] 丁海霞, 王富軍, 黃曉偉, 等. 不同途徑移植臍帶血干細胞對兔2型糖尿病的療效觀察. 中華細胞與干細胞雜志(電子版), 2016, 6(6):334-338.

    [6] 徐谷根, 肖毅, 尹卓娜, 等. 不同部位臍血干細胞移植治療糖尿病大鼠的效果研究. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2015, 9(13):

    134-136.

    [7] Bell GI, Meschino MT, Hughes-Large JM, et al. Combinatorial human progenitor cell transplantation optimizes islet regeneration through secretion of paracrine factors. Stem Cells & Development, 2012, 21(11):1863.

    [8] Cheng H, Zhang YC, Wolfe S, et al. Combinatorial treatment of bone marrow stem cells and stromal cell-derived factor 1 improves glycemia and insulin production in diabetic mice. Molecular & Cellular Endocrinology, 2011, 345(1-2):88-96.

    [9] Karnieli O, Izhar-Prato Y, Bulvik S, et al. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells, 2010, 25(11):2837-2844.

    [10] Si Y, Zhao Y, Hao H, et al. Infusion of Mesenchymal Stem Cells Ameliorates Hyperglycemia in Type 2 Diabetic Rats. Diabetes, 2012, 61(6):1616.

    [11] Liu X, Zheng P, Wang X, et al. A preliminary evaluation of efficacy and safety of Whartons jelly mesenchymal stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cell Research & Therapy, 2014, 5(2):57.

    [12] Zhao Y, Jiang Z, Zhao T, et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase Ⅰ/Ⅱclinical trial. Bmc Medicine, 2013, 11(1):160.

    [13] 申晶. 骨髓源間充質干細胞輸注促進STZ誘導的糖尿病大鼠胰腺內α細胞向β細胞的轉變:糖尿病治療的新模式. 中國人民解放軍醫(yī)學院, 2013.

    [14] Liu X, Zheng P, Wang X, et al. A preliminary evaluation of efficacy and safety of Whartons jelly mesenchymal stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cell Research & Therapy, 2014, 5(2):57.

    猜你喜歡
    胰島空腹胰腺
    采血為何要空腹
    中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:52:12
    同時多層擴散成像對胰腺病變的診斷效能
    空腹運動,瘦得更快?
    胰島β細胞中鈉通道對胰島素分泌的作用
    空腹喝水
    哪些胰腺“病變”不需要外科治療
    家兔胰島分離純化方法的改進
    18例異位胰腺的診斷與治療分析
    非編碼RNA在胰島發(fā)育和胰島功能中的作用
    生命科學研究(2012年3期)2012-04-29 00:44:03
    午夜视频国产福利| av在线app专区| 国产免费又黄又爽又色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久热精品热| 十分钟在线观看高清视频www | 性色av一级| 日韩电影二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 极品人妻少妇av视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 丝袜脚勾引网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av在线播放精品| 另类精品久久| 大香蕉久久网| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美人与善性xxx| 免费高清在线观看视频在线观看| 成人影院久久| 另类精品久久| 三级经典国产精品| av免费在线看不卡| 热99国产精品久久久久久7| 乱人伦中国视频| 91成人精品电影| 久久久久久久久久久丰满| 欧美成人精品欧美一级黄| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费看av在线观看网站| 精品亚洲成国产av| 日韩一区二区视频免费看| 国产探花极品一区二区| 色网站视频免费| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 青青草视频在线视频观看| 一本久久精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99热这里只有精品一区| 日韩一区二区视频免费看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产一区二区在线观看av| 午夜福利视频精品| 99热这里只有是精品在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品色激情综合| 在线观看美女被高潮喷水网站| 五月天丁香电影| 超碰97精品在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 黄色一级大片看看| 国产黄片美女视频| 男女免费视频国产| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲欧洲国产日韩| 有码 亚洲区| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男人狂女人下面高潮的视频| 97在线人人人人妻| 色5月婷婷丁香| 日本免费在线观看一区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩在线观看h| 亚洲自偷自拍三级| 天堂8中文在线网| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精品,欧美精品| 国产探花极品一区二区| 插逼视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 精品久久久久久电影网| 国产综合精华液| 国产精品久久久久成人av| 久久99热6这里只有精品| 在线 av 中文字幕| 热re99久久精品国产66热6| av视频免费观看在线观看| 插逼视频在线观看| 少妇丰满av| 国产综合精华液| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费黄频网站在线观看国产| 少妇高潮的动态图| 国产精品成人在线| 97在线视频观看| 嫩草影院入口| 在线观看www视频免费| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲国产精品999| 在线观看av片永久免费下载| 最近最新中文字幕免费大全7| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 三上悠亚av全集在线观看 | 日本色播在线视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 99热全是精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 男女免费视频国产| 99热网站在线观看| 久久影院123| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲精品,欧美精品| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久精品精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩免费高清中文字幕av| 18禁动态无遮挡网站| 免费看日本二区| 高清毛片免费看| 久久久久久久久久久免费av| av免费在线看不卡| 一本色道久久久久久精品综合| 嫩草影院新地址| 曰老女人黄片| 国产爽快片一区二区三区| 三级经典国产精品| freevideosex欧美| 国产亚洲91精品色在线| 国模一区二区三区四区视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| av专区在线播放| 黄色日韩在线| 亚洲怡红院男人天堂| 久久久久久伊人网av| 中文字幕av电影在线播放| 最后的刺客免费高清国语| 香蕉精品网在线| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲无线观看免费| av有码第一页| 精品熟女少妇av免费看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| √禁漫天堂资源中文www| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99久久综合免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲人成网站在线观看播放| 永久免费av网站大全| 我的女老师完整版在线观看| 国产亚洲最大av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲av国产av综合av卡| 大码成人一级视频| 美女福利国产在线| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲第一av免费看| 少妇的逼水好多| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品熟女久久久久浪| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | av在线app专区| 伦理电影大哥的女人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久久精品性色| 极品少妇高潮喷水抽搐| 99热这里只有是精品50| 久久av网站| 国产精品国产三级专区第一集| 午夜91福利影院| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 视频区图区小说| av在线播放精品| 另类精品久久| 中文资源天堂在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品一区三区| 在线 av 中文字幕| 精品一区二区三区视频在线| 乱人伦中国视频| 黄色日韩在线| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产永久视频网站| 国产一区二区在线观看av| 一二三四中文在线观看免费高清| 日本黄色片子视频| 国产日韩欧美在线精品| 永久免费av网站大全| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久精品性色| 男人添女人高潮全过程视频| 久久99精品国语久久久| 天堂8中文在线网| 亚洲av不卡在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av.av天堂| 一本大道久久a久久精品| 老女人水多毛片| 亚洲精品一二三| 国产av精品麻豆| 久久久久精品久久久久真实原创| 高清av免费在线| 下体分泌物呈黄色| 日韩视频在线欧美| 国产熟女欧美一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 热re99久久精品国产66热6| 国产毛片在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲成人一二三区av| 黄色配什么色好看| av播播在线观看一区| 欧美精品国产亚洲| 我要看黄色一级片免费的| 少妇精品久久久久久久| 国产成人freesex在线| 黄色一级大片看看| 国产 一区精品| 国产综合精华液| 少妇熟女欧美另类| 亚洲av不卡在线观看| 伦精品一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av成人精品一二三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 三级国产精品片| 中文资源天堂在线| 交换朋友夫妻互换小说| 高清av免费在线| 亚洲国产色片| 亚洲第一av免费看| 成人毛片a级毛片在线播放| 女人精品久久久久毛片| 精品少妇内射三级| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 午夜视频国产福利| 波野结衣二区三区在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜福利视频精品| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久国产网址| 又大又黄又爽视频免费| 毛片一级片免费看久久久久| 99热6这里只有精品| 熟女av电影| 国产一区二区三区av在线| av国产精品久久久久影院| 日日啪夜夜爽| 成人毛片60女人毛片免费| √禁漫天堂资源中文www| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲三级黄色毛片| 在线看a的网站| 成人影院久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产一区二区在线观看日韩| 美女xxoo啪啪120秒动态图| av女优亚洲男人天堂| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产永久视频网站| 少妇的逼好多水| 亚洲人与动物交配视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产永久视频网站| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品一二三区在线看| 麻豆成人av视频| 亚洲av成人精品一二三区| 国产亚洲精品久久久com| 99久久精品一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 九草在线视频观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品少妇内射三级| 夜夜爽夜夜爽视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 18禁在线播放成人免费| 国产一级毛片在线| 五月开心婷婷网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲伊人久久精品综合| 性色avwww在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久久伊人网av| 一本大道久久a久久精品| 久久这里有精品视频免费| 国产精品福利在线免费观看| 美女内射精品一级片tv| 中文字幕久久专区| av福利片在线| 日韩免费高清中文字幕av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品偷伦视频观看了| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产亚洲欧美精品永久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩综合久久久久久| 国产亚洲一区二区精品| 久久久欧美国产精品| 亚洲综合色惰| 亚洲欧美清纯卡通| h视频一区二区三区| 精品久久久久久久久亚洲| 热99国产精品久久久久久7| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲国产av新网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产成人精品福利久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲自偷自拍三级| 国产一级毛片在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 搡老乐熟女国产| 香蕉精品网在线| 22中文网久久字幕| 午夜福利视频精品| 中文资源天堂在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久国产精品大桥未久av | 国产毛片在线视频| 久久久久视频综合| 丰满饥渴人妻一区二区三| 人人妻人人看人人澡| 精品久久久久久电影网| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久久久久久大av| 日韩一区二区三区影片| av福利片在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久久久久久久久丰满| freevideosex欧美| 一本久久精品| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲第一av免费看| 国产精品免费大片| 另类亚洲欧美激情| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 99精国产麻豆久久婷婷| 大香蕉97超碰在线| 男的添女的下面高潮视频| 简卡轻食公司| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久精品久久久久久久性| 中文欧美无线码| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 秋霞在线观看毛片| av播播在线观看一区| 免费看av在线观看网站| 99热国产这里只有精品6| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇被粗大猛烈的视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲怡红院男人天堂| 伊人久久国产一区二区| 大码成人一级视频| 午夜视频国产福利| 天堂8中文在线网| 国产成人freesex在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人亚洲欧美一区二区av| 好男人视频免费观看在线| 波野结衣二区三区在线| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲电影在线观看av| 国内精品宾馆在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 最近2019中文字幕mv第一页| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产欧美亚洲国产| 精华霜和精华液先用哪个| 国产视频首页在线观看| 在线观看www视频免费| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产精品一区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 制服丝袜香蕉在线| 久久国内精品自在自线图片| 看十八女毛片水多多多| 国产av国产精品国产| 国产伦在线观看视频一区| 免费av中文字幕在线| 美女中出高潮动态图| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品蜜桃在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 精品人妻偷拍中文字幕| 熟女人妻精品中文字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品熟女久久久久浪| 国产熟女欧美一区二区| videossex国产| 五月开心婷婷网| 久久青草综合色| 久久久久久久久久成人| 国产亚洲最大av| 午夜免费观看性视频| 99热网站在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲av中文av极速乱| 国产精品熟女久久久久浪| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美精品国产亚洲| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 成年人午夜在线观看视频| 国产毛片在线视频| 极品人妻少妇av视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产免费一级a男人的天堂| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲图色成人| 少妇人妻久久综合中文| 精品一品国产午夜福利视频| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一区二区三区av在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 免费播放大片免费观看视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久97久久精品| 国产熟女欧美一区二区| 免费黄色在线免费观看| 26uuu在线亚洲综合色| 国产色爽女视频免费观看| 一级a做视频免费观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲久久久国产精品| 六月丁香七月| 欧美精品一区二区大全| 久热久热在线精品观看| 最近最新中文字幕免费大全7| a级一级毛片免费在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲av二区三区四区| 久久国内精品自在自线图片| 国产免费一级a男人的天堂| 99热这里只有是精品在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 色视频在线一区二区三区| 亚洲成人av在线免费| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 性色avwww在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品久久久久久久久免| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产伦理片在线播放av一区| 成人无遮挡网站| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久久视频综合| 欧美+日韩+精品| 一级毛片我不卡| 日韩人妻高清精品专区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美日本中文国产一区发布| 一本一本综合久久| 黄片无遮挡物在线观看| tube8黄色片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜av观看不卡| av在线老鸭窝| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品第二区| 26uuu在线亚洲综合色| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 嘟嘟电影网在线观看| 各种免费的搞黄视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美成人午夜免费资源| 黑人猛操日本美女一级片| 伦理电影大哥的女人| 国产精品一区www在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 免费人成在线观看视频色| 国产av国产精品国产| 永久免费av网站大全| 18禁动态无遮挡网站| 久久久国产一区二区| 黄色配什么色好看| 国产精品一区www在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产伦精品一区二区三区四那| 高清不卡的av网站| 久久久久久久久久久久大奶| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久亚洲国产成人精品v| 最后的刺客免费高清国语| 在线看a的网站| 51国产日韩欧美| 国产精品无大码| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品久久精品一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 蜜桃久久精品国产亚洲av| a级毛片免费高清观看在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲精品成人av观看孕妇| 桃花免费在线播放| 尾随美女入室| 一本一本综合久久| 少妇丰满av| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品少妇久久久久久888优播| 国产免费一级a男人的天堂| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 久久人人爽人人片av| 女人精品久久久久毛片| 内射极品少妇av片p| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国内揄拍国产精品人妻在线| 蜜桃在线观看..| 99久久精品国产国产毛片| 婷婷色综合大香蕉| 国产在线男女| 一本久久精品| 精华霜和精华液先用哪个| 秋霞伦理黄片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品成人在线| 一级爰片在线观看| 高清不卡的av网站| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产av国产精品国产| 亚洲精品自拍成人| 亚洲图色成人| 人人澡人人妻人| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产深夜福利视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美成人午夜免费资源| 一级二级三级毛片免费看| 久久99一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 哪个播放器可以免费观看大片| 久久婷婷青草| 能在线免费看毛片的网站| 哪个播放器可以免费观看大片| 人妻 亚洲 视频| 丰满少妇做爰视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级爰片在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 中文欧美无线码| 午夜免费观看性视频| 日韩免费高清中文字幕av| 少妇丰满av| 国产成人一区二区在线| 简卡轻食公司| 日韩大片免费观看网站|