釀酒酵母W5核酸內(nèi)切酶基因HO的克隆及生物信息學(xué)分析

尹紫良，王長麗，葛菁萍

黑龍江大學(xué)a. 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱150500；b. 生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150080

隨著釀酒酵母全基因組測序的完成，有關(guān)其各種組學(xué)的理論研究也已經(jīng)十分透徹[1]，作為世界上公認(rèn)的真核模式生物[2]，近年來其應(yīng)用領(lǐng)域逐漸呈現(xiàn)出多元化，在能源探索[3-5]、學(xué)科研究[6-7]、環(huán)境保護(hù)[8]、食品生產(chǎn)[9-10]及疾病模式探索[11-13]等相關(guān)領(lǐng)域不斷取得重大進(jìn)展。

大量研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在傳代過程中普遍存在一種特殊的現(xiàn)象即倍性回復(fù)，而倍性的變化會引起基因組的不穩(wěn)定[14]。通常情況下，釀酒酵母為單倍體或二倍體，自然界中還存在多倍體[15]，其細(xì)胞配型由MAT轉(zhuǎn)座子編碼的信息決定[16]，研究人員根據(jù)MAT基因座遺傳信息的差異，將單倍體菌株分為MATa 型（a 型）和MATα型（α型）2 種接合型，而單倍體a 型和α型會與母細(xì)胞發(fā)生同宗接合形成二倍體[17]。釀酒酵母這種單雙倍體相互交替的現(xiàn)象[18]，除了受環(huán)境等外界因素的影響外，核酸內(nèi)切酶HO基因（也稱為同宗接合基因）起著決定性的作用，該基因所編碼的位點特異性重組酶[19-21]會在MAT交配型位點處產(chǎn)生特異性雙鏈斷裂，完成沉默供體位點和活化位點之間的信息轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致母細(xì)胞（MATa）與子細(xì)胞（MATα）之間發(fā)生MATa 與MATα的相互轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生同宗接合或異宗配合現(xiàn)象。異宗配合型菌株的交配型是穩(wěn)定的，而同宗接合型單倍體菌株由于HO基因的表達(dá)，所以其交配型很不穩(wěn)定[15]。同宗接合現(xiàn)象并非時刻都會發(fā)生，研究表明，在外界環(huán)境適宜的情況下，單倍體酵母細(xì)胞通過芽殖的方式沿母細(xì)胞軸向生成子細(xì)胞，子細(xì)胞則會產(chǎn)生一種參與DNA 修復(fù)過 程 的Ash1 蛋白[22]，它 會 抑制HO基因的表達(dá)，進(jìn)而使單倍體菌株不能發(fā)生同宗接合形成二倍體細(xì)胞。目前，對于酵母核酸內(nèi)切酶HO基因的研究已經(jīng)不僅僅局限于酵母傳代領(lǐng)域，它還涉及了包括酵母分子水平機(jī)制探究在內(nèi)的諸多方面。

由此可以看出，HO基因在釀酒酵母單倍體的研究中具有非常重要的作用。本研究中，我們以實驗室前期篩選得到的一株二倍體釀酒酵母W5（MATa/α）為出發(fā)菌株，通過引物設(shè)計進(jìn)行PCR，克隆其HO基因并做相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，這為今后對該酵母進(jìn)行單倍體構(gòu)建及二倍體回復(fù)、探討HO基因?qū)伪扼w的穩(wěn)定性具有先期的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母W5（用于基因組提取及目的基因克?。?、大腸桿菌DH5α（用于目的基因克隆轉(zhuǎn)化）均由黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室提供；供試質(zhì)粒pMD18-T，限制性內(nèi)切酶SalⅠ、XbaⅠ購自大連（寶）生物工程有限公司；TaqDNA 聚合酶、PfuDNA聚合酶購自Fermentas 公 司；BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit、BioSpinGel Extraction Kit 購自杭州博日科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit、TIANquick Midi Purification Kit購自北京天根生化科技有限公司。

LB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，121℃濕熱滅菌15 min，用于大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)。

YPD 培養(yǎng)基:蛋白胨2 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖2 g/L，pH 自然，108℃濕熱滅菌20 min，用于釀酒酵母W5 菌株的培養(yǎng)。

改良YPD 培養(yǎng)基:蛋白胨0.3 g/L，酵母提取物0.8 g/L，葡萄糖10 g/L，ZnSO4·7H2O 25 mg/L，pH 自然，108℃濕熱滅菌20 min，用于產(chǎn)孢前釀酒酵母W5 菌株的培養(yǎng)。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI 中序列號為NC_001136.10 的釀酒酵母S288C 染色體Ⅳ上的HO基因序列，用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物對，用來克隆和擴(kuò)增釀酒酵母W5 的HO基因序列。上游引物（HO-up）為5'-AGCAGATGCGCGCACCTG-3'。

1.3 釀酒酵母W5基因組DNA的提取及HO基因的克隆與鑒定

用TIANamp Bacteria DNA Kit 提取釀酒酵母W5 基因組DNA，再以獲得的基因組DNA 為模板，對HO基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30 次循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR 反應(yīng)體系:dNTP 混合液（2.5 mmol/L）4 μL、釀酒酵母W5 DNA（25 ng/μL）10 μL、Pfu聚合酶緩沖液（添加Mg2+）5 μL、HO-up（1 pmol/μL）5 μL、HO-down（1 pmol/μL）5 μL、PfuDNA 聚合酶（2.5 U/μL）1 μL、ddH2O 20 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物用TIAN-quick Midi Purification Kit純化后與pMD18-T 載體相連，通過熱激法將連有HO基因片段的T 載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白篩選獲得陽性克隆子，菌液PCR 和限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XbaⅠ雙酶切驗證后送博仕生物技術(shù)有限公司測序并命名為pTSW-HO。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用BLAST 軟件對HO基因序列進(jìn)行ORF Finder 分析及同源性分析；利用DNAMAN 軟件對HO基因序列進(jìn)行翻譯，獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列后，對該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、理論等電點、氨基酸組成、原子組成、消光系數(shù)、半衰期、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、親（疏）水性的平均值及磷酸化位點進(jìn)行分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/；https://web.expasy.org/protparam/）；對該基因序列進(jìn)行RPS-Blast 分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、HO蛋白跨膜區(qū)及重復(fù)序列分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；http://www.ebi.ac.uk/Radar/）；構(gòu)建該蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)模型（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html；http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1），進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析（http://www.psort.org/psortb/index.html）。

2 結(jié)果

2.1 釀酒酵母W5基因組DNA提取及目標(biāo)基因克隆

1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見在大于15 000 bp處有一條清晰的條帶，說明成功地提取了釀酒酵母W5 基因組DNA（圖1A）。以釀酒酵母W5 基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增獲得的目的條帶與預(yù)期相符，約為1760 bp（圖1B）。BglⅡ/XhoⅠ雙酶切驗證（圖1C）和菌液PCR 驗證（圖1D）結(jié)果與預(yù)期相符，說明HO基因克隆成功。

圖1 釀酒酵母W5 基因組DNA（A）、HO 基因PCR 產(chǎn)物（B）、質(zhì)粒pTSW-HO 雙酶切產(chǎn)物（C）、菌液HO 基因PCR 產(chǎn)物（D）

2.2 HO基因的生物信息學(xué)分析

測序后獲得的核苷酸序列長度為1760 bp，利用NCBI 的ORF Finder 程序分析，發(fā)現(xiàn)該基因序列擁有一個完整的開放讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼的蛋白由586 個氨基酸殘基構(gòu)成，預(yù)測相對分子質(zhì)量為66 089.13，理論等電點（pI）為9.32，為堿性蛋白質(zhì)。根據(jù)測序結(jié)果登錄NCBI，用BLAST 數(shù)據(jù)庫分析釀酒酵母W5 的HO基因序列，結(jié)果顯示所測序列與釀酒酵母Y169（NCBI:CP033473.1）HO基因序列100%一致，與釀酒酵母YJM1326（NCBI:CP004710.2）HO基因序列有99.94%的一致性，與釀酒酵母Evolution Canyon#3（NCBI:GQ923584.1）HO基因完整的CDS 序列有99.60%的一致性，與克隆載體pHCT2 蛋白完整序列（NCBI:KT725395.1）100%一致，與釀酒酵母HCNKIsf G7 染色體Ⅳ蛋白序列（NCBI:CP008171.1）有99.32%的一致性。比對結(jié)果說明，測序所得的核苷酸序列為編碼同源轉(zhuǎn)換核酸內(nèi)切酶的基因序列。

氨基酸組成預(yù)測分析表明，釀酒酵母W5HO基因所編碼的HO 蛋白序列中Lys 含量較高，達(dá)8.9%，整個序列中有65 個強(qiáng)酸性氨基酸、93 個強(qiáng)堿性氨基酸；氨基酸分子式為C2917H4659N841O847S32，原子總數(shù)為9296 個，預(yù)測其在280 nm 水溶液中的消光系數(shù)為67 030；預(yù)估半衰期＞20 h；預(yù)測其脂肪族氨基酸指數(shù)為78.0；親水性分析表明HO蛋白的親水性平均值為-0.471；蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析表明HO 蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.28，是一種不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；在PROSITE 數(shù)據(jù)庫中檢索到HO基因編碼的蛋白質(zhì)的功能性基序和位點在215～370 之間，為內(nèi)含肽DOD 歸巢內(nèi)切核酸酶，歸巢核酸內(nèi)切酶由內(nèi)含肽和內(nèi)含子編碼的稀有切割酶組成，它們可以識別的DNA 序列比經(jīng)典限制酶大得多。

如圖2A 所示，HO基因編碼的蛋白質(zhì)的疏水性最大值為1.722。磷酸化位點分析預(yù)測可知（圖2B），該基因編碼的蛋白質(zhì)序列中有21 個Ser、18個Thr、12 個Tyr。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，HO蛋白有7.50%的可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，有1.15%的可能存在于細(xì)胞質(zhì)膜，有0.73%的可能存在于周質(zhì)空間，因此將HO 蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。將該蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析（圖2C），結(jié)果顯示HO 蛋白不含跨膜區(qū)，該結(jié)論也支持了亞細(xì)胞定位分析的結(jié)果。

將本試驗獲得的HO基因片段進(jìn)行RPS-Blast分析（圖2D），結(jié)果顯示該片段有4 個保守區(qū)域。其中，PRK14898 區(qū)域是一個信號接收區(qū)，具有DNA 指導(dǎo)的RNA 聚合酶亞基調(diào)節(jié)系統(tǒng)中激酶保守區(qū)域的功能；HintN 區(qū)域是分割結(jié)構(gòu)域，以適應(yīng)大量內(nèi)切核酸酶的插入。

將HO 蛋白進(jìn)行重復(fù)序列分析（圖2E），結(jié)果表明在該蛋白質(zhì)中可能存在19 個重復(fù)序列，但這些氨基酸序列并非完全相同。

利用Hopfield 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）預(yù)測釀酒酵母W5 的HO 蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)主要由不規(guī)則卷曲、α螺旋及延伸鏈構(gòu)成（圖2F）。其中，不規(guī)則卷曲占51.71%，α螺旋占27.82%，延伸鏈占20.48%（藍(lán)色示α螺旋、紅色示延伸鏈、紫色示不規(guī)則卷曲）。在得到該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)信息的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了其三級結(jié)構(gòu)（圖2G）。

3 討論

近幾年來，釀酒酵母配型研究已經(jīng)從單純的表觀遺傳控制方面[23-24]上升到對其機(jī)理及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜的探究水平，人類探索未知的渴望和對科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖非髴B(tài)度，也使得釀酒酵母配型的研究更加完善和系統(tǒng)化。但目前對于釀酒酵母核酸內(nèi)切酶HO基因的研究，主要還是圍繞著人們所關(guān)心的代謝路徑等方面的改造上。因此，我們對HO這一關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析，可以在某些方面填補(bǔ)該基因在釀酒酵母研究領(lǐng)域的空白，為更好地利用這一基因，對目的菌株進(jìn)行改造和重組打下堅實的基礎(chǔ)。正如本文開頭所提及的，隨著科技的進(jìn)步，人們在窮盡各種方法，利用現(xiàn)存科技手段，對釀酒酵母進(jìn)行更加深入的功能發(fā)掘，這也在很大程度上導(dǎo)致了對于釀酒酵母的遺傳穩(wěn)定性[25]、代謝可控性及菌株的運(yùn)行成本等的更高要求。

釀酒酵母作為研究真核細(xì)胞的“模式生物”，其某些研究成果可以轉(zhuǎn)移到高等真核生物體內(nèi)進(jìn)行[7]，因此對釀酒酵母的研究一直較為活躍，而且在大量研究過程中，人們都直接或間接地對釀酒酵母的HO基因進(jìn)行了修飾，用以獲得其預(yù)期研究結(jié)果[14-30]。本研究對HO基因的生物信息學(xué)分析，不僅僅局限于對基因信息的簡單陳述，而且還對該基因的轉(zhuǎn)錄水平、空間位置及酶學(xué)信息等進(jìn)行了科學(xué)的計算機(jī)模擬，得到的數(shù)據(jù)與科學(xué)實踐所得到的信息高度一致，這對于該基因的生物學(xué)信息匯總及完善有重要意義，可為今后在該領(lǐng)域的相關(guān)研究提供更加準(zhǔn)確、便捷的HO基因信息，也可為研究路線的進(jìn)一步優(yōu)化提供一定的理論參考。

綜上，本研究以實驗室前期篩選得到的一株二倍體釀酒酵母W5（MATa/α）為出發(fā)菌株，利用PCR 技術(shù)從其全基因組中克隆得到該菌株的核酸內(nèi)切酶基因HO片段，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)該序列無堿基缺失，且通過NCBI 的ORF Finder 程序分析發(fā)現(xiàn)該基因序列具有完整的開放讀框，與NCBI中釀酒酵母Y169 的HO基因序列100%一致，與釀酒酵母YJM1326 的HO基因序列有99.94%的一致性。同時，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)分析得到其

編碼的HO 蛋白的強(qiáng)酸強(qiáng)堿性氨基酸所占比例有明顯差異，與預(yù)測等電點相符，存在蛋白激酶位點，亞細(xì)胞定位分析HO 蛋白存在于細(xì)胞核內(nèi)，屬于堿性胞內(nèi)蛋白。

圖2 HO 蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果