重組人表皮生長(zhǎng)因子在畢赤酵母中的表達(dá)與純化及其復(fù)合可溶性微針的制備

熊振宇，李曉瑾，李志鵬

天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津300457

表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）是一類普遍存在于人類多種腺體及體液中且具備生物活性的多肽，參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的增殖、遷移、分化等重要的生物學(xué)過程[1]。EGF 最初由美國(guó)Vanderbilt 大學(xué)醫(yī)學(xué)系Cohen 教授用羧甲基纖維素柱從小鼠頜下腺分離純化神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）時(shí)發(fā)現(xiàn)[2]。1975 年，Starkey 等[3]從人尿中提取出人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF），由于其可抑制胃酸分泌，又稱抑胃素。EGF 由53 個(gè)氨基酸殘基組成，其中含有6 個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基，Cys 殘基之間形成3 個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵，使整條肽鏈成為具有三內(nèi)環(huán)形結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)。在過去30 年中，有關(guān)EGF 及EGF 受體（EGFR）的研究揭示了EGF 控制細(xì)胞正常生長(zhǎng)和傷口愈合的分子機(jī)理[4]。EGF 具有多種生物功能，如作為強(qiáng)有力的廣譜細(xì)胞促分裂因子可以促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移[5-6]，加快物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和糖代謝，同時(shí)對(duì)外科手術(shù)切口和眼角膜創(chuàng)傷愈合具有促進(jìn)作用[7]。

EGF 有著廣泛的應(yīng)用前景，但天然的EGF 獲得渠道卻十分有限，由于產(chǎn)量問題的制約無法滿足臨床和實(shí)踐的需求[8]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展與完善，可以利用該技術(shù)制備高產(chǎn)量、高活性的EGF。大腸桿菌、酵母等是目前應(yīng)用最為廣泛的宿主菌。但由于EGF 在大腸桿菌中表達(dá)多以包涵體的形式存在[9]，而在酵母表達(dá)系統(tǒng)中不存在此問題，且巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一[10]。在此，我們構(gòu)建了表達(dá)重組hEGF（rhEGF）-His 融合蛋白的畢赤酵母工程菌，以期高效獲得高純度的EGF，用于研究和應(yīng)用。

微針（microneedle，MN）陣列作為1976 年提出的新劑型[11]，已有40 多年發(fā)展歷史，而可生物降解的聚合物微針是微針技術(shù)發(fā)展的一個(gè)方向，可以提高微針的安全性。高分子可溶性微針用水溶性高分子材料制備而成，能夠在針體中包覆藥物進(jìn)入皮下，部分或完全溶解并釋放藥物[12]。其優(yōu)點(diǎn)為原料來源廣泛，制備方法相對(duì)簡(jiǎn)單，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等，從而增加了給藥方面的優(yōu)勢(shì)。大分子和小分子化合物都可以作為微針的負(fù)載物。其中，大分子化合物主要用于疾病預(yù)防[13]和糖尿病的治療[14]，而小分子化合物已廣泛用于治療、診斷、美容等[15]。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種良好的透皮吸收劑[16]，我們以小分子透明質(zhì)酸為基質(zhì)制備了攜帶rhEGF 的可溶性微針，解決了rhEGF 分子過大，無法有效透皮吸收的問題，同時(shí)對(duì)微針造成的微小創(chuàng)口有較好的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Top10、畢赤酵母X33-rhEGF-His 基因工程菌、表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA 均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；PfuDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、TaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ、DNA marker、蛋白預(yù)染marker、博來霉素為Thermo 公司產(chǎn)品；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒、酵母浸出物、胰蛋白胨、硫酸銨、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、PVP K30、PEG400、角鯊?fù)橘?gòu)自上海生工生物工程有限公司；Ni-beads 為GE 公司產(chǎn)品；10 kD 透明質(zhì)酸鈉、甘油、無水乙醇購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物合成和基因測(cè)序由北京金唯智公司完成。

1.2 pPICZαA-hEGF-His 表達(dá)載體的構(gòu)建

查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)hEGF-His基因，在兩端加入XhoⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)化學(xué)合成獲得，連接到pUC57 載體上，然后用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切目的基因片段及載體pPICZαA，37℃水浴2 h，用膠回收試劑盒回收正確條帶后，將目的基因與空載體混合并用T4DNA 連接酶于16℃恒溫過夜連接，而后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及基因測(cè)序。

1.3 構(gòu)建畢赤酵母X33-pPICZαA-hEGF-His 表達(dá)工程菌與抗性篩選

取測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pPICZαA-hEGF-His 用限制性內(nèi)切酶SacⅠ線性化，同時(shí)制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒到畢赤酵母X33 中，并將其涂在不同博來霉素濃度的YPD平板上，挑選單克隆提取基因組，以基因組為模板，采用AOX1-F（5'-GACTGGTTCCAATTGACAA GC-3'）和AOX1-R（5'-GCAAATGGCATTCTGACA TCC-3'）雙引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min）驗(yàn)證陽性菌株。對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否能夠得到預(yù)期大小的基因片段，分析基因是否整合到酵母基因組中。將驗(yàn)證正確的菌株進(jìn)行小量表達(dá)，篩選高表達(dá)菌種。

1.4 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)rhEGF-His 蛋白

選擇篩選出的高表達(dá)菌株接種至YPD 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，后接種于BMGY 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至菌液D600nm值 為4～6，更換至BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行EGF 的誘導(dǎo)表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)下連續(xù)培養(yǎng)5 d，每隔12 h 補(bǔ)加0.5%的甲醇且每24 h 取樣，對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)，用銀染法和Western 印跡分析目的蛋白。

1.5 rhEGF-His 的純化

對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，用甲醇誘導(dǎo)120 h 后收集發(fā)酵液離心取上清。選擇合適的硫酸銨鹽析濃度，對(duì)收集到的蛋白進(jìn)行沉淀和濃縮。將初步處理過的蛋白與Ni-beads 孵育結(jié)合，后用咪唑洗脫。

1.6 制備可溶性微針防水背襯層

考慮其柔韌性、溶解性、厚度等方面，綜合得出最優(yōu)的背襯層配方為膜材料聚乙烯醇0.800 g，增稠劑羧甲基纖維素鈉0.400 g，增塑劑甘油0.800 g，水10 mL。80℃恒溫?cái)嚢?，待完全溶解混勻后保溫靜置5 min 去除部分氣泡，3000 r/min 離心4～10 min，完全去除氣泡后傾倒于75 mm 的玻璃平板上，放置到50℃烘箱中干燥2 h。

選擇疏水性物質(zhì)乙基纖維素為主要防水成分，用乙醇做溶劑配制濃度為10%的乙基纖維素溶液（10 mL 無水乙醇，1 g 乙基纖維素，共10 mL）倒于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，放置于烘箱中至膜干燥成形（大約1 h）。

1.7 微針層的制備及檢測(cè)

使用對(duì)人體無副作用的EGF 和透明質(zhì)酸濃度，即10 kD 透明質(zhì)酸鈉濃度10 mg/mL，EGF 濃度為10 mg/L。以EGF 和透明質(zhì)酸為主要成分，水為溶劑配制針尖溶液。通過對(duì)比篩選實(shí)驗(yàn)，確定針體溶液由0.15 g PVP K30、40 μL PEG400、0.01 g 角鯊?fù)楹?00 μL 無菌水配制而成。采用真空填充或浸潤(rùn)填充（即將模板置于水溶液中超聲高速離心）的方法，使溶液充分地對(duì)模具進(jìn)行填充，將適量的針尖溶液（約30 μL）加入模具表面，水平放置干燥10 min 后加入120 μL 針體溶液，后用注射器進(jìn)行簡(jiǎn)易加壓操作，20℃干燥24 h。將制備好的微針貼片分別置于4℃冰箱、-20℃冰箱和常溫（天津市濱海新區(qū)，20℃）下，觀察微針形態(tài)變化。

通過對(duì)比微針對(duì)保鮮膜和豬皮的穿透性，檢測(cè)微針整體塑性是否達(dá)到給藥預(yù)期要求。將制備完成的微針以人體正常力度按壓在保鮮膜上，靜置2 min 后撕下。與此同時(shí)進(jìn)行更深一步的塑性實(shí)驗(yàn)，將制備好的微針用正常力度按壓貼于去毛后經(jīng)生理鹽水活化30 min 后的豬皮上，靜置2 min 后撕下，并對(duì)豬皮進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色。

為了驗(yàn)證EGF-His 透明質(zhì)酸可溶性微針是否能夠起到幫助傷口愈合的作用，我們采用4 只5周SD 大鼠進(jìn)行創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)。對(duì)4 只大鼠背部進(jìn)行脫毛處理后，用手術(shù)刀劃出1 cm 長(zhǎng)、1 mm 深的十字形傷口，止血消毒后將4 只大鼠分為2 組，實(shí)驗(yàn)組傷口處敷有EGF-His 微針貼片，24 h 定期更換，對(duì)照組定期消毒。觀察大鼠背部傷口愈合情況和傷疤存留情況。待傷口愈合后對(duì)背部皮膚組織進(jìn)行石蠟切片和HE 染色。

2 結(jié)果

2.1 pPICZαA-hEGF-His 表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的EGF-His基因序列插入pPICZαA 空載體之后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，提取質(zhì)粒并用XhoⅠ/NotⅠ做雙酶切驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示酶切獲得的目的DNA 條帶大小與預(yù)期EGF-His基因大小一致，即218 bp（圖1）。將重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的基因進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果完全一致，表明重組質(zhì)粒pPICZαA-hEGF-His構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA-hEGF-His 的雙酶切驗(yàn)證

2.2 pPICZαA-hEGF-His 畢赤酵母X33 表達(dá)工程菌的構(gòu)建與篩選

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPICZαA-hEGF-His 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，挑選單克隆并提取基因組，然后以此為模板用AOX1 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，所挑選的轉(zhuǎn)化子均有目的DNA 條帶，且大小與預(yù)期一致（圖2A），即721 bp，說明所挑選的4株單克隆均轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒pPICZαA-hEGFHis，且整合到了酵母基因組上。

將所挑選的4 株陽性單克隆分別進(jìn)行小量表達(dá)，分別取120 h 時(shí)發(fā)酵樣經(jīng)SDS-PAGE 分析。與陰性對(duì)照相比，4 株菌株均分泌表達(dá)了目的產(chǎn)物，大小與預(yù)期一致，相對(duì)分子質(zhì)量約6.5×103（圖2B），且4 號(hào)菌株的表達(dá)量明顯高于其他3 株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所挑選的4 株陽性單克隆均能夠分泌表達(dá)目的產(chǎn)物，其中的4 號(hào)菌株表達(dá)量最高，將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高產(chǎn)菌種。

圖2 pPICZαA-hEGF-His 畢赤酵母X33 工程菌的構(gòu)建及篩選

2.3 重組蛋白EGF-His 在畢赤酵母X33 中的誘導(dǎo)表達(dá)及驗(yàn)證

對(duì)篩選出的高產(chǎn)菌株誘導(dǎo)表達(dá)5 d，每天定時(shí)取上清樣1 次，經(jīng)SDS-PAGE 并用銀離子染色分析。與對(duì)照相比，發(fā)酵液中目的蛋白EGF-His含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且第5 d 達(dá)到最高表達(dá)量（圖3A）。用Western 印跡檢測(cè)表達(dá)過程取樣中目的蛋白含量的變化情況，結(jié)果顯示，目的蛋白含量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，與銀染結(jié)果一致（圖3B），通過His 抗體檢測(cè)也驗(yàn)證了所表達(dá)產(chǎn)物為EGF-His。

圖3 hEGF-His 在畢赤酵母X33 中的誘導(dǎo)表達(dá)和Western 印跡驗(yàn)證

2.4 重組蛋白EGF-His 的純化

將發(fā)酵5 d 的發(fā)酵液離心，取上清液用90%的硫酸銨進(jìn)行沉淀，將得到的蛋白沉淀用PBS 復(fù)溶，然后與Ni-beads 孵育。結(jié)果表明，在500 mmol/L 咪唑濃度下洗脫出目的蛋白，而在1 mol/L咪唑濃度時(shí)洗脫蛋白較少（圖4）。根據(jù)蛋白銀染結(jié)果，除洗脫獲得的目的蛋白EGF-His 外，看不到其他雜蛋白條帶，表明獲得純度較高的重組蛋白EGF-His。

圖4 重組蛋白EGF-His 的純化

2.5 EGF-His 蛋白可溶性微針的制備及物理性能檢測(cè)

制備微針防水層和背襯層溶液的干燥時(shí)間視傾注溶液體積而定，10 mL 干燥2 h，15 mL 干燥4 h，以此類推。干燥后剝離取出，防水層是塑料質(zhì)感的透明薄片，背襯層是柔軟親膚的透明薄片。依次配置防水層、背襯層，二者有著良好的結(jié)合效果。

圖5 EGF-透明質(zhì)酸可溶性微針的制備和物理性能檢測(cè)

為使EGF 富集于針尖部分，使藥物更好地進(jìn)入皮下，減少藥物的損失，透明質(zhì)酸可溶性微針采用分段配制微針的方法，保證EGF 的最大化利用。選用的微針基質(zhì)PVP K300 具有較大的粘性，輕輕按壓撕下便可得到結(jié)合于背襯層上的具有完整矩陣的微針。顯微鏡下觀察針型，由圖可見針型尖銳鋒利，排列有序（圖5A），表明微針制備完好，可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

保鮮膜穿透預(yù)實(shí)驗(yàn)證明微針硬度較好，可穿透保鮮膜使其具有整齊排列的針孔。在豬皮穿透實(shí)驗(yàn)中，觀察貼后的微針針型，發(fā)現(xiàn)針尖有效成分已溶解（圖5B）。在染色的豬皮上可明顯觀察到排列整齊的藍(lán)色針孔（圖5C），說明微針針尖具有一定的穿刺性和溶解性良好。由于可溶性微針含有小分子透明質(zhì)酸成分，有助于填補(bǔ)微針的在皮膚上留下的針孔及對(duì)皮下起到一定的補(bǔ)水作用，同時(shí)角鯊?fù)橐材苓M(jìn)一步保濕滋潤(rùn)抗氧化，促進(jìn)有效成分的透皮吸收。微針穿刺2 min后，豬皮的針孔就可以逐漸愈合（圖5D）。

通過對(duì)微針保存條件的實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)-20℃保存條件下微針針型消失（圖5E），而4℃（圖5F）和室溫（圖5G）的保存環(huán)境對(duì)微針針型無明顯影響，且穿刺性能良好。由于EGF 在室溫條件下容易失活，而-20℃雖然保證了EGF 的活性但穿刺性顯著下降，所以4℃保存是微針最適合的保存條件。

2.6 EGF-His 蛋白可溶性微針的生物學(xué)活性檢測(cè)

自大鼠創(chuàng)傷手術(shù)后，我們對(duì)其傷口進(jìn)行了10 d 貼片治療和觀察。手術(shù)24 h 后，實(shí)驗(yàn)組SD大鼠的傷口已經(jīng)開始逐漸愈合，對(duì)照組大鼠傷口處凝有血塊，顏色暗沉疑似中途有過再次出血；觀察6 d 后，實(shí)驗(yàn)組SD 大鼠傷口完全結(jié)痂脫落，僅留有輕微疤痕，背部毛發(fā)重新生長(zhǎng)，而對(duì)照組大鼠傷口仍未完全愈合，傷痂并未脫落完全。飼養(yǎng)第10 d 時(shí)對(duì)照組傷口才完全愈合，但留有較明顯的傷痕，周圍新生毛發(fā)已經(jīng)重新長(zhǎng)出；而第10 d 實(shí)驗(yàn)組大鼠背部的傷痕已經(jīng)完全消失，未發(fā)現(xiàn)其他后遺癥狀（圖6A）。將4 只SD 大鼠處死，進(jìn)行背部皮膚組織切片和HE 染色。淡粉紅色物質(zhì)為膠原纖維，而亮粉紅色為彈力纖維，對(duì)比2 組的染色結(jié)果（圖6B），發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠組織纖維情況較對(duì)照鼠更好，纖維狀況也更加致密。

圖6 SD 大鼠背部皮膚創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)

3 討論

基因工程技術(shù)已成為一種高效的制備天然蛋白質(zhì)的技術(shù)手段。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源基因的表達(dá)得到了最早的應(yīng)用，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最早、最為廣泛，但也存在適用范圍有限、蛋白純化難度高、產(chǎn)物多為包涵體形式的局限。相比于大腸桿菌，酵母表達(dá)系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，所表達(dá)的人源蛋白均具有更好的生物活性，并且可以進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，更加適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用甲醇營(yíng)養(yǎng)型表達(dá)系統(tǒng)的巴斯德畢赤酵母表達(dá)EGF-His 蛋白，甲醇不僅可以誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)目的蛋白，而且可以作為畢赤酵母生長(zhǎng)的碳源和能源，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，也不產(chǎn)生內(nèi)毒素等有害和致病性物質(zhì)。在純化過程中用硫酸銨沉淀蛋白進(jìn)行濃縮，而后利用親和層析技術(shù)進(jìn)一步純化。我們?cè)O(shè)計(jì)在目的蛋白后添加了His 標(biāo)簽，這就使得可以通過Ni-beads進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的純化，從而可以比較簡(jiǎn)便地獲得高純度的EGF-His 蛋白。據(jù)報(bào)道，6×His 標(biāo)簽一般不影響蛋白的分泌、定位和折疊[17]。

由于EGF 蛋白透皮率較低[18]，使EGF 的應(yīng)用受到了極大的限制。因此，以可溶性微針為載體，可以促進(jìn)EGF 的透皮吸收，增加其應(yīng)用價(jià)值。由于EGF 蛋白在常溫使用時(shí)存在穩(wěn)定性差、易降解等缺點(diǎn)，我們加入了PVP[19]和透明質(zhì)酸[16]來保持微針中EGF 的生物活性。研究采用澆鑄法，以EGF 和透明質(zhì)酸為活性成分、PVP K300 為微針材料、PVA 為背襯材料，分層制備了可溶性的EGF 微針貼片。經(jīng)過篩選優(yōu)化，確定了合適的微針層處方和背襯層處方，且在其中加入吸濕性物質(zhì)，使其可以保持干燥以免受潮變形，便于保存。在制備過程中，我們發(fā)現(xiàn)須先配置防水層，待防水層干燥后將配好的背襯層溶液傾倒于上述培養(yǎng)皿內(nèi)（防水層溶液可比背襯層少，盡量做到防水層占總防水背襯層厚度的三分之一以下），水平置于烘箱內(nèi)干燥。待膜成形后，從培養(yǎng)皿內(nèi)剝離，可方便地獲得一面可防水的背襯層。

我們制備的EGF-可溶性微針貼片具有良好的穿刺性、可溶性及生物學(xué)活性，且操作簡(jiǎn)單，易于保存，為后期大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。