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    人類復(fù)制因子C4在肺腺癌進(jìn)展中的初步功能探究

    2019-09-27 02:26:58祁昕齊書山吳鵬濤
    生物技術(shù)通訊 2019年4期
    關(guān)鍵詞:小室細(xì)胞系生存期

    祁昕,齊書山,吳鵬濤

    北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院 胸心血管外科,北京102400

    肺癌位列全球癌癥相關(guān)死亡原因之首[1],其中約85%的肺癌被歸類為非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC),其被細(xì)分為鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞癌。肺腺癌是最常見的肺癌亞類,占NSCLC 病例的65%,占所有肺癌的40%以上[2]。因此,了解肺腺癌的致癌信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,確定治療該疾病的新治療靶點(diǎn)很有必要。

    研究證實(shí),肺腺癌的發(fā)生與體內(nèi)一些基因(包括癌基因、抑癌基因等)的突變有關(guān)[3-8]。人類復(fù)制因子C 第四大亞基(human replication factor C subunit 4,RFC4)在DNA 合成和DNA 損傷后的DNA 修復(fù)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[9-10]。據(jù)報(bào)道,該基因在多種惡性腫瘤,如前列腺癌、宮頸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和肝癌中表達(dá)失調(diào)[11-16]。然而,RFC4 在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用仍不清楚。在本研究中,我們探討了RFC4 在肺腺癌中的表達(dá)水平,并確定了RFC4 在肺腺癌中的潛在生物學(xué)功能。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1437,人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;RFC4 抗體、β-actin 抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自Abcam 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 染料購自TaKa-Ra 公司;10%胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基購自Hyclone 公 司;LipofectAMINE RNAiMAX Reagent試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司;TRIzol試劑購自Invitrogen 公司;Matrigel 基質(zhì)膠購自BD公司;Transwell 小室購自Corning 公司。

    1.2 數(shù)據(jù)挖掘分析

    通過starBase Pan-Cancer 分析平臺(tái)(http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php)分析從癌癥基因組圖譜(TCGA)獲取的RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)數(shù)據(jù);通過Kaplan-Meier plotter 分析平臺(tái)(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)分析RFC4 基因與肺腺癌生存預(yù)后的關(guān)系。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基,在37℃含5% CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用LipofectAMINE RNAiMAX Reagent 試劑盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,敲低RFC4 的表達(dá)。siRNA 序列為RFC4 siRNA sense(5'-GACCAAGGAUCGAGGAGUAdTd T-3')和RFC4 siRNA antisense(3'-dTdTCUGGUU CCUAGCUCCUCAU-5')。

    1.4 RNA提取和qRT-PCR

    用TRIzol 試劑盒提取總RNA,PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA,用ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR System 檢測儀和SYBR Green qPCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。以β-actin 為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參,2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。RFC4 正向引物為5'-TT GTATCGCGGAAACCTGAGGAAC-3',反向引物為5'-ACTGGCAGCTACTCCTCGATCCTT-3';β-actin正向引物為5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3',反向引物為5'-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3'。

    1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

    提取細(xì)胞總蛋白,10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白,用電轉(zhuǎn)儀將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液封閉膜后,將膜與抗體孵育過夜,PBST 清洗后再與二抗孵育,清洗后加入化學(xué)顯色液,放至凝膠成像儀中觀察。

    1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

    取對數(shù)生長期細(xì)胞制成懸液,以1×105/孔接種于96 孔板,分別在1、2、3 和4 d 進(jìn)行CCK-8 檢測,通過酶標(biāo)儀測定D450nm值,D450nm值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D450nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長圖。

    1.7 Transwell法檢測細(xì)胞遷移

    取對數(shù)生長期細(xì)胞制成懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL。在下室加入600 μL 含10%血清的培養(yǎng)基,上室加入150 μL 細(xì)胞懸液,每種細(xì)胞種3 個(gè)小室,培養(yǎng)24 h 后取出小室,擦去小室內(nèi)表面未穿膜的細(xì)胞,甲醇固定15 min,DPAI 染核10 min,PBS 清洗后,在熒光顯微鏡下觀察視野并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

    1.8 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲

    將凍存的Matrigel 基質(zhì)膠于4℃放置至液態(tài),與無血清培養(yǎng)基以5∶1 混勻,每個(gè)小室加入100 μL 混合液,在37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h。其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    用GraphPad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以為x±s表示,組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和方差分析,兩兩多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 RFC4在肺腺腺癌組織中的表達(dá)

    starBase 分析526 例肺腺癌組織和59 例正常對照組織結(jié)果顯示(圖1),RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常對照組織(P<0.05),說明RFC4 在肺腺癌組織中高表達(dá)。

    圖1 starBase 分析TCGA 中RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)

    2.2 RFC4表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

    利用Kaplan-Meier plotter 分析RFC4 表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性,結(jié)果見圖2,高水平的RFC4 表達(dá)與不良總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS)顯著相關(guān)(P分別為0.0018、0.021),RFC4表達(dá)越高,患者的OS 和RFS 就越低,預(yù)后越差。

    圖2 RFC4 表達(dá)對肺腺癌預(yù)后的影響

    2.3 RFC4在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

    從圖3 可以看出,RFC4 在2 種肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1437 中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B(P<0.05),這與RFC4 在肺腺癌組織中的表達(dá)一致。

    2.4 RFC4siRNA沉默效率檢測

    為了進(jìn)一步研究RFC4 在肺腺癌細(xì)胞中的功能,將RFC4 siRNA 分別轉(zhuǎn)染A549 和H1437 細(xì)胞,并在mRNA 和蛋白水平檢測RFC4 siRNA 的沉默效率,結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)染siRNA 后,A549 和H1437細(xì)胞中的RFC4 mRNA 表達(dá)均顯著降低(P<0.05);同樣地,A549 和H1437 細(xì)胞中的RFC4 蛋白表達(dá)也明顯低于對照(P<0.05)。

    2.5 RFC4siRNA對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

    肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染RFC4 siRNA 后,RFC4 的表達(dá)降低(圖4),si-RFC4 肺腺癌細(xì)胞的增殖活力也明顯降低(圖5)。同時(shí),隨著RFC4 的表達(dá)降低,si-RFC4 肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力也顯著低于對照(圖6)。此結(jié)果說明,RFC4 的表達(dá)對肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有促進(jìn)作用。

    圖3 RFC4 在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

    圖4 RFC4 siRNA 轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞后RFC4 的表達(dá)

    圖5 RFC4 siRNA 對肺腺癌細(xì)胞增殖的影響(*P<0.05)

    圖6 RFC4 siRNA 對肺腺癌細(xì)胞遷移/侵襲的影響(*P<0.05)

    3 討論

    肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤[1]。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見的亞型,每年致50 多萬人死亡[17]。雖然目前用于治療肺癌的靶向藥物已經(jīng)獲得了一些進(jìn)展,但耐藥、復(fù)發(fā)等問題也隨著靶向藥物的使用而出現(xiàn),所以探究肺癌的治療靶點(diǎn)仍十分必要。

    RFC4 在真核生物DNA 復(fù)制和DNA 損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[9-10]。癌細(xì)胞無限增殖和易分散轉(zhuǎn)移的生物特性,可能與癌細(xì)胞中RFC4 的表達(dá)失調(diào)有關(guān)。先前的研究表明RFC4 在不同癌癥中高表達(dá)也證明了這一點(diǎn),如在結(jié)直腸癌、肝癌中RFC4 均過度表達(dá)[15-16]。在本研究中,RFC4 在肺腺癌組織和細(xì)胞中均高表達(dá),并且與肺腺癌預(yù)后有較強(qiáng)的相關(guān)性,RFC4 表達(dá)越高,肺腺癌患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期越低,預(yù)后較差。這些結(jié)果表明RFC4 可能在肺腺癌中發(fā)揮致癌作用。

    為了進(jìn)一步研究RFC4 與肺腺癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系,我們通過RFC4 siRNA 轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞,敲低了RFC4 在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。采用CCK-8 法和Transwell 法檢測發(fā)現(xiàn),RFC4 的表達(dá)降低使肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降,說明RFC4 在肺腺癌細(xì)胞增殖進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。

    綜上所述,RFC4 在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá),且與肺腺癌預(yù)后關(guān)系密切。RFC4 的表達(dá)促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究為開發(fā)肺腺癌新的預(yù)后標(biāo)志物提供了研究思路,RFC4 可以作為肺腺癌新的治療策略的潛在靶標(biāo),但涉及的詳細(xì)分子機(jī)制仍須進(jìn)一步探究。

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