基于α-突觸核蛋白原纖維的帕金森氏疾病模型的研究進(jìn)展

羅海玉，吳正存，馬開(kāi)利

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，藥物安全性評(píng)價(jià)研究中心，昆明 650118；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心&神經(jīng)科學(xué)中心，北京 100005)

帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥[1]，其主要的臨床癥狀表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙和靜止性震顫，并且常伴隨有抑郁和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀[2]。一旦發(fā)病，將對(duì)患者的身心造成嚴(yán)重?fù)p害，同時(shí)，給整個(gè)家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。PD的主要病理學(xué)表現(xiàn)為中腦多巴胺能神經(jīng)元死亡和紋狀體損失，主要的病理學(xué)標(biāo)志為中腦黑質(zhì)致密部形成的路易小體(Lewy bodies，LBs)[1, 3]。LBs是黑質(zhì)致密部可見(jiàn)部分的一種球狀包涵體，主要成分為部分中空的放射狀淀粉樣纖維，而該淀粉樣纖維的主要成分為α-突觸核蛋白(α-synuclein，AS)[3]。

1988年，Maroteaux等人[4]在電鱘體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了AS的存在，并且確定了其位于突觸前末梢和核周。隨后，AS被證實(shí)是LBs的主要成分并且與PD的發(fā)生有密切的關(guān)系，并且越來(lái)越多的研究將AS作為了PD致病機(jī)制研究中的關(guān)鍵蛋白。近年來(lái)，有大量研究表明，異常聚集的AS具有類朊病毒樣的傳播特性，其能夠在神經(jīng)元細(xì)胞之間進(jìn)行傳播，導(dǎo)致腦內(nèi)更多AS聚集體的產(chǎn)生，最終造成大腦中負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)區(qū)域的神經(jīng)元死亡[5-6]。于是，研究者們將AS原纖維接種于原代神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量包涵體并且發(fā)現(xiàn)其磷酸化水平明顯升高[7]。同時(shí)，利用AS原纖維建立的PD動(dòng)物模型能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量類LBs的包涵體，與PD病人的病理特征相類似[8]。更重要的是，相比于傳統(tǒng)的神經(jīng)毒性模型和過(guò)表達(dá)AS的轉(zhuǎn)基因模型，利用AS原纖維建立的PD模型，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性AS的水平更接近于人類的生理水平并且其病理變化更類似于人類的病癥[8]。因此，利用AS原纖維建立PD模型，將有望成為研究體內(nèi)PD樣LB病理學(xué)的通用造模方法。因此，本文就基于AS原纖維的帕金森氏疾病模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 AS的結(jié)構(gòu)及傳播

1.1 AS的結(jié)構(gòu)

AS是一種由140個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約為14 × 103。AS具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)(如圖1)，其中1 ～ 60號(hào)殘基為N-末端(氨基端)，介導(dǎo)了AS與脂質(zhì)膜的結(jié)合[9]；60 ～ 95號(hào)殘基為NAC結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域被認(rèn)為是檢測(cè)AS聚集的重要指標(biāo)[10]。1 ～ 95號(hào)殘基共同組成了脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括了7個(gè)11-mer(11個(gè)氨基酸殘基)的重復(fù)序列，KTKGEV為其共有序列，與載脂蛋白類似，形成兩個(gè)α-螺旋、三個(gè)轉(zhuǎn)角[9-10]。所有與突觸核蛋白病相關(guān)的已鑒定的突變位點(diǎn)都位于該區(qū)域：A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T[11]。AS的96 ～ 140號(hào)殘基為C-末端(羧基端)，是高度酸性的不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，也是各種翻譯后修飾的靶標(biāo)[12]。C-末端是AS與各類蛋白質(zhì)、離子、聚陽(yáng)離子相互作用的部位，同時(shí)也調(diào)節(jié)了AS的膜結(jié)合，以及保護(hù)AS免于聚集[13]。

注：在與脂質(zhì)膜結(jié)合后，AS的N-末端結(jié)構(gòu)域折疊成兩個(gè)兩親性螺旋；AS的C-末端尾部不會(huì)促進(jìn)膜結(jié)合。脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以分成七個(gè)高度保守的11-mer序列。α-螺旋-2包含易聚集的NAC結(jié)構(gòu)域。AS的所有疾病相關(guān)突變位于第二和第四11-mer伸展中。圖1 AS的結(jié)構(gòu)域示意圖Note. Upon binding to the lipid membrane, the N-terminal domain of AS folds into two amphipathic helices; the C-terminal tail of AS does not promote membrane binding. The lipid binding domain can be divided into seven highly conserved 11-mer sequences. α-Helix-2 contains a cluster of NACs that are susceptible to aggregation. All disease-associated mutations in AS are located in the second and fourth 11-mer stretches.Figure 1 Schematic diagram of the AS domains

1.2 AS在體內(nèi)的生理病理構(gòu)象及傳播

正因?yàn)锳S的結(jié)構(gòu)特性，導(dǎo)致了其在體內(nèi)的構(gòu)象容易發(fā)生改變(如圖2)，AS的異常構(gòu)象對(duì)于PD病理學(xué)的傳播和神經(jīng)元功能障礙來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。AS本質(zhì)上是一種無(wú)序的蛋白質(zhì)，正常生理狀態(tài)下是自然伸展的單體形式，但是不同的環(huán)境條件會(huì)影響其構(gòu)象的可塑性。AS單體在體內(nèi)以兩種狀態(tài)存在，即可溶狀態(tài)(天然非結(jié)構(gòu)化)和膜結(jié)合狀態(tài)(部分螺旋構(gòu)象)。當(dāng)體內(nèi)環(huán)境改變時(shí)，天然非結(jié)構(gòu)化的單體可以通過(guò)部分折疊的成核結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為寡聚體，寡聚體最終會(huì)轉(zhuǎn)化為高度有序的β-折疊淀粉樣蛋白原纖維，但目前寡聚體的轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不清楚[14]。天然非結(jié)構(gòu)化蛋白質(zhì)也會(huì)形成無(wú)序結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致了其他無(wú)序聚集體的形成[15]。AS的這種聚集傾向正是導(dǎo)致PD的主要原因之一。另外，高度有序的AS原纖維具有類朊病毒樣傳播特性，會(huì)形成原纖維種子，在神經(jīng)元細(xì)胞之間進(jìn)行傳播[16]。

AS會(huì)在體內(nèi)傳播的首次報(bào)道來(lái)自于一位有22年P(guān)D病史的患者，為了減輕紋狀體多巴胺的損失，其在1993年接受了6.5 ～ 9周齡的胚胎干細(xì)胞移植[17]。2008年，也是其移植手術(shù)的14年后，研究者們?cè)谄渲心X黑質(zhì)內(nèi)新移植的神經(jīng)元細(xì)胞中檢測(cè)出了LBs[17-18]。隨后，研究者們?cè)谛∈篌w內(nèi)對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)注射了AS原纖維的小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)了大量具備PD病理特征的LBs樣包涵體[19]。已有研究表明，原纖維種子從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的傳播可通過(guò)直接穿透、內(nèi)吞作用或受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)等多種方式發(fā)生[20-21]。最新研究表明，原纖維的生長(zhǎng)和傳播在AS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡中發(fā)揮著核心作用，研究如何抑制原纖維的生長(zhǎng)傳播對(duì)PD和其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療有重要意義[22-23]。然而，驅(qū)動(dòng)原纖維種子傳遞和增殖的生理化學(xué)條件以及控制體內(nèi)聚集體生長(zhǎng)和擴(kuò)增速率的因子至今仍不清楚。

注：正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞溶質(zhì)中的AS是自然伸展的單體形式。在與突觸小泡結(jié)合后，AS發(fā)生錯(cuò)誤折疊，N-末端殘基變?yōu)槁菪Y(jié)構(gòu)。病理狀態(tài)下，錯(cuò)誤折疊的AS發(fā)生聚集形成具有細(xì)胞毒性的寡聚體，同時(shí)，AS會(huì)轉(zhuǎn)化為含β-折疊的原纖維，最終形成淀粉樣蛋白原纖維。AS原纖維會(huì)形成原纖維種子，在神經(jīng)元細(xì)胞之間進(jìn)行傳播，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)可溶性AS的合成。圖2 AS在體內(nèi)的生理病理構(gòu)象及傳播過(guò)程N(yùn)ote. Under normal physiological conditions, the cytosolic AS naturally occurs in the monomeric form. After binding to synaptic vesicles, AS misfolds and the N-terminal residue becomes a helical structure. Under pathological conditions, misfolded AS aggregates to form cytotoxic oligomers and is converted to β-sheet-containing fibrils, eventually forming amyloid fibrils. AS fibrils form fibril seeds that propagate between neuronal cells and promote the synthesis of soluble AS in cells.Figure 2 Physiological and pathological conformation and propagation of AS in vivo

2 基于AS原纖維的PD模型的研究進(jìn)展

2.1 基于AS原纖維的細(xì)胞模型

基于AS原纖維的傳播特性，尤其能誘發(fā)一系列接近人生理病理的PD特征，采用AS原纖維制備各種細(xì)胞、動(dòng)物模型成為了PD造模中的一大熱點(diǎn)。2009年，Luk等[24]首次將外源性的重組AS原纖維添加到過(guò)表達(dá)AS的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系內(nèi)(QBI-HEK-293和SH-SY5Y)，建立了AS原纖維的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)可溶性的AS發(fā)生聚集，同時(shí)磷酸化和泛素化水平都上調(diào)。該AS原纖維的細(xì)胞模型概括了PD病人腦中LBs的關(guān)鍵特征。相比于傳統(tǒng)的PD神經(jīng)毒性模型和過(guò)表達(dá)AS的腺相關(guān)病毒系統(tǒng)模型[25-26]，AS原纖維的PD細(xì)胞模型的優(yōu)點(diǎn)是可以在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中產(chǎn)生類似真正的路易體和路易神經(jīng)突的包涵體。2011年，Volpicelli-Daley等[27]將外源性的AS原纖維接種于原代神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)了路易體病變，并最終導(dǎo)致了突觸功能障礙和神經(jīng)元死亡。隨后，其又發(fā)現(xiàn)AS原纖維會(huì)被神經(jīng)元攝取，最終導(dǎo)致內(nèi)源性的AS發(fā)生聚集并形成LBs，所產(chǎn)生的包涵體首先在軸突當(dāng)中形成，然后逐漸擴(kuò)散到體細(xì)胞和樹(shù)突當(dāng)中[28]。更加有趣的是，AS原纖維也能被星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取(胞吞作用)，并且能夠在原代神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間進(jìn)行傳播，對(duì)細(xì)胞造成毒性作用[29]。在接種外源性AS原纖維的原代神經(jīng)元細(xì)胞中，外源性的AS原纖維誘導(dǎo)了內(nèi)源性表達(dá)的AS形成包涵體，與人類的PD病理特征非常相似。同時(shí)，最新研究表明，AS原纖維對(duì)原代神經(jīng)元的細(xì)胞毒性程度強(qiáng)于細(xì)胞系的毒性作用[30]。

由于AS原纖維獨(dú)特的傳播特性以及其能夠作為高效建立PD細(xì)胞模型的全新材料，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行深入的研究。2019年，Tanaka等[31]發(fā)現(xiàn)當(dāng)AS發(fā)生自發(fā)聚集時(shí)，會(huì)形成不同結(jié)構(gòu)的多態(tài)性原纖維；而將AS進(jìn)行接種時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生具有傳播特性的原纖維種子。在AS原纖維的PD細(xì)胞模型中，當(dāng)原纖維接種于原代神經(jīng)元7 d后，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中自發(fā)性的Ca2+瞬變的頻率和幅度都會(huì)減小[32]，并且當(dāng)神經(jīng)元還未死亡時(shí)，軸突中的內(nèi)含物便會(huì)選擇性地?fù)p害攜帶TrkB受體和LC3陽(yáng)性自噬體內(nèi)體的軸突運(yùn)輸，導(dǎo)致軸突轉(zhuǎn)運(yùn)功能損傷[33]。該研究提示，神經(jīng)毒性和突觸功能相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)可以作為PD風(fēng)險(xiǎn)防范的臨床前的診斷方式之一。

但是，AS原纖維究竟是通過(guò)什么途徑在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的，仍不清楚。最近，有研究者發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬是由AS原纖維持續(xù)積累引起的溶酶體損傷引起的[34]。最新研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)化的AS原纖維會(huì)導(dǎo)致溶酶體活性受損，但對(duì)蛋白酶體活性和線粒體在受體細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)不會(huì)造成影響[35]。與此相反，也有大量研究表明，AS原纖維會(huì)優(yōu)先與線粒體結(jié)合，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙[36-37]。這些研究結(jié)果提示，或許可以將細(xì)胞器作為介入的靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究AS原纖維在PD中的作用機(jī)制。

2.2 基于AS原纖維的動(dòng)物模型

正如上文所提到的，AS原纖維的PD細(xì)胞模型可以誘導(dǎo)產(chǎn)生類LBs和路易神經(jīng)突的包涵體。隨后，研究者們將AS原纖維定位注射于小鼠(以及大鼠)腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠的海馬、皮質(zhì)、中腦以及其他的大腦區(qū)域的神經(jīng)元中都出現(xiàn)了類LBs的包涵體[38-39]，這可幫助我們更好地去研究不同神經(jīng)元群體的功能。因?yàn)椴恍枰D(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)人AS，所以相比于傳統(tǒng)的過(guò)表達(dá)AS的腺相關(guān)病毒系統(tǒng)模型[26]，利用外源性的AS原纖維建立PD動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)是可以直接利用基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠研究任何我們感興趣的基因?qū)奂w形成的影響。

至今，越來(lái)越多的研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該模型的有效性和可操作性。Paumier等與Suzukake等[38, 40]將超聲后的AS原纖維注射到小鼠(和大鼠)的紋狀體、SNpc、內(nèi)嗅皮質(zhì)，甚至是小鼠(和大鼠)的肌肉中，發(fā)現(xiàn)無(wú)論注射部位如何，AS包涵體不僅會(huì)在注射部位形成，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)在遠(yuǎn)離注射部位的其他腦區(qū)，并且注射后4周，可檢測(cè)到小鼠30%的TH陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)生了損失(大鼠50%)，另外，即使當(dāng)原纖維僅注射在紋狀體的單側(cè)且AS包涵體僅出現(xiàn)在注射側(cè)時(shí)，另外一側(cè)也能檢測(cè)出神經(jīng)元損傷和功能障礙[38]。

利用這一模型，Tran等[41]發(fā)現(xiàn)使用針對(duì)病理性AS的抗體可以防止AS的擴(kuò)散和毒性作用的產(chǎn)生。他們的研究發(fā)現(xiàn)，在接受原纖維注射的小鼠中，注射單克隆抗體減少了病理性AS的產(chǎn)生，并且SNpc中的多巴胺能神經(jīng)元損失減少，運(yùn)動(dòng)行為也得到了改善[41]。因此，基于AS原纖維的PD動(dòng)物模型的這些實(shí)驗(yàn)證明了免疫療法有可能成為預(yù)防PD的全新療法?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，Luan等[42]將AS原纖維模型用于研究慢性咖啡因的治療效果，發(fā)現(xiàn)慢性咖啡因治療降低了pSer129的聚集、神經(jīng)元細(xì)胞的死亡以及小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并且還發(fā)現(xiàn)該治療可以選擇性地逆轉(zhuǎn)由AS誘導(dǎo)以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬缺陷。這些發(fā)現(xiàn)提示了一種與環(huán)境因素相關(guān)的通過(guò)靶向自噬途徑來(lái)治療PD的新型藥理學(xué)療法。2019年，Bieri等[43]使用AS原纖維的PD模型，對(duì)與AS聚集有關(guān)的修飾物進(jìn)行了與PD相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因的靶向遺傳篩選，發(fā)現(xiàn)LRRK2和GBA基因的表達(dá)下調(diào)，會(huì)促進(jìn)小鼠原代神經(jīng)元中的AS發(fā)生聚集；并且，在過(guò)表達(dá)與PD連鎖的LRRK2突變基因的小鼠中檢測(cè)到了AS的聚集。同時(shí)，也有研究者發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性LRRK2蛋白的減少，會(huì)降低該P(yáng)D模型中AS包涵體的形成[44]。這些研究揭示了LRRK2蛋白在PD中的重要作用，并且提供了一種潛在的PD治療策略。

3 結(jié)語(yǔ)

總而言之，開(kāi)發(fā)PD模型的目的是為了了解疾病是如何發(fā)展，以及如何采取有效的措施減緩或阻止疾病的發(fā)生。PD的AS原纖維模型概括了PD的許多特征：神經(jīng)元丟失、具有生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的包涵體、類LBs和路易神經(jīng)突、整個(gè)大腦的病理學(xué)擴(kuò)散以及運(yùn)動(dòng)行為缺陷等[45-46]。另外，相比于傳統(tǒng)的PD神經(jīng)毒性模型和過(guò)表達(dá)AS的腺病毒系統(tǒng)模型，PD的原纖維模型表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)越性[45, 47]。因此，基于AS原纖維的PD模型大大提高了我們對(duì)PD的理解。