生物發(fā)光人肝癌裸小鼠原位癌模型的構(gòu)建

趙 源，張超超，路 璐，吳文斌，朱賢丹，樊海艇，丁 越*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 201315； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201315)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是全球惡性程度最高的消化系統(tǒng)癌癥之一[1-2]，并且臨床上手術(shù)切除等傳統(tǒng)治療效果差，術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率高[3-4]。國(guó)內(nèi)外研究人員做了許多關(guān)于癌癥轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)性工作，獲得了顯著的成果，但現(xiàn)在急需一些符合臨床研究需求的合格動(dòng)物肝癌模型，用于抗腫瘤新藥的篩選。

常用于癌癥研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是裸小鼠，因其天然缺乏免疫力，而且該品系動(dòng)物形態(tài)較小，易于飼養(yǎng)及運(yùn)用小動(dòng)物成像儀評(píng)價(jià)。HCCLM3細(xì)胞株是中山醫(yī)院肝病所運(yùn)用重復(fù)多次肺轉(zhuǎn)移篩選法，從人肝癌MHCC97H細(xì)胞株裸小鼠皮下接種模型的肺轉(zhuǎn)移灶挑選所得[5]。肝癌的高死亡率及療效差的根本原因是肝癌患者五年內(nèi)易發(fā)生轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，基于以上考慮，我們構(gòu)建一個(gè)可定量分析腫瘤轉(zhuǎn)歸過程的癌癥動(dòng)物模型，利用該模型篩選具有抗癌活性的中藥新藥及評(píng)價(jià)適合的肝癌治療手段[6-7]。

熒光素酶基因是一種ATP酶的報(bào)告基因，其成像原理為熒光素酶(luciferase，Luc)、ATP、熒光底物(D-luciferin)、Mg2+與O2為底物，在Mg2+催化條件下，轉(zhuǎn)化化學(xué)能為光能，并激發(fā)的光譜位于560 nm之間的可見光，對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞無電離輻射作用，正常組織器官的機(jī)能不受影響[8-10]。利用活體成像設(shè)備可以定量分析標(biāo)記細(xì)胞在機(jī)體體表的表達(dá)區(qū)域以及產(chǎn)生光子數(shù)量。生物發(fā)光人肝癌裸小鼠原位癌模型是可用于模擬人類肝癌的生長(zhǎng)增殖情況，而且利用小動(dòng)物活體成像儀可客觀地、有效地定量分析動(dòng)物模型，該模型可用于癌癥治療手段評(píng)估、抗癌癥復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移效果及篩選抗癌中藥新藥等領(lǐng)域。將在本文中著重研究HCCLM3-Luc肝癌裸小鼠原位癌模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c-nu裸小鼠20只，6周齡左右，雄性，體重18～20 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK (滬) 2013-0016]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)屏障系統(tǒng)[SYXK (滬) 2014-0008]IVC籠架內(nèi)，自由攝取飼料、飲水，飼料由60Co輻射滅菌，墊料、飲水、籠具等均經(jīng)蒸汽高壓滅菌，環(huán)境溫度控制在18℃ ～ 25℃，相對(duì)濕度40% ～ 70%。動(dòng)物購(gòu)入經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)方案和動(dòng)物操作均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號(hào)：SZY 201803004。

1.1.2 細(xì)胞系

穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶Luc的人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系(HCCLM3-Luc)保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心附屬實(shí)驗(yàn)室內(nèi)液氮罐中。

1.2 主要試劑與儀器

D-熒光素鉀鹽(英國(guó)，Perkin Elmer公司，批號(hào)K9909PE)；胎牛血清(以色列，BioInd公司，批號(hào)：1608795)；DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)，HyClone公司，批號(hào)：AE26543270)；紅霉素眼藥膏(中國(guó)，馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：180202)?？焖贉缇?中國(guó)，上海曉航貿(mào)易有限公司，型號(hào)FST350)；小鼠獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)(意大利，泰尼百斯有限公司，型號(hào)S.P.A)；小動(dòng)物麻醉機(jī)(中國(guó)，上海乾福生物科技有限公司，型號(hào)MSS-3)；高壓滅菌器(日本，三洋機(jī)電株式會(huì)社，型號(hào)HVE 50)；冷光源燈(中國(guó)，瑞沃德生命科技公司，型號(hào)F-150C)；活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)(美國(guó)，珀金埃爾默股份有限公司，型號(hào)Lumina Ⅱ Living Image 4.3型)；CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)，Binder有限公司，型號(hào)：binder cell 150型)；倒置熒光顯微鏡及熒光成像系統(tǒng)(中國(guó)，麥克奧迪(廈門)實(shí)業(yè)集團(tuán)，型號(hào)：BA400EF-UPR)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇

將存有HCCLM3-Luc的凍存管從液氮罐中取出，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，其間用鑷子夾住細(xì)胞凍存管在溫水中輕輕晃動(dòng)，使凍存管內(nèi)細(xì)胞可均勻受熱快速融解。用微量移液槍充分混勻解凍的HCCLM3-Luc細(xì)胞液，然后抽取1 mL細(xì)胞液加入預(yù)存有10 mL室溫PBS的離心管，再用移液管反復(fù)吹打、混勻若干次。用低溫離心機(jī)以800 r/min離心5 min，棄上清液，再加入10 mL室溫PBS，重復(fù)三次。用移液槍輕輕懸浮細(xì)胞，并加入完全培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)細(xì)胞。接種細(xì)胞到50 mL的培養(yǎng)瓶中，起始密度為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇的細(xì)胞懸液接種至含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，定容至10 mL，800 r/min低速離心5 min，棄上清液，加新鮮的高糖DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打多次，重懸細(xì)胞液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中增殖培育。每天在倒置顯微鏡下觀察HCCLM3-Luc細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況，并根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行換液、轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增。

1.3.3 細(xì)胞收集

收集進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3-Luc細(xì)胞，將生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞懸液用PBS溶液漂洗3次，在倒置顯微鏡下使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，調(diào)定細(xì)胞數(shù)量，將PBS重懸的細(xì)胞懸液暫存于盛有碎冰盒內(nèi)，爭(zhēng)取30 min內(nèi)完成皮下注射及尾靜脈注射細(xì)胞懸液的實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 活體成像儀檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶表達(dá)情況

將傳代培養(yǎng)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3-Luc細(xì)胞按不同細(xì)胞數(shù)量(1×105、5×104、2.5×104、1.25×104、5×103、2.5×103)分別置于無菌96孔細(xì)胞板中，利用小動(dòng)物活體成像儀測(cè)定不同細(xì)胞數(shù)量HCCLM3-Luc細(xì)胞的熒光素酶生物發(fā)光表達(dá)情況，探索細(xì)胞數(shù)量與熒光素酶生物發(fā)光值的線性關(guān)系。

1.3.5 HCCLM3-Luc尾靜脈注射構(gòu)建肝癌原位癌動(dòng)物模型

選用6只裸小鼠，先用醫(yī)用消毒片輕輕從裸小鼠尾尖部開始擦拭2 min，擴(kuò)張尾部血管，助手輕輕壓迫裸小鼠尾部雙側(cè)靜脈，操作人員用1 mL胰島素注射器抽取已重懸HCCLM3-Luc細(xì)胞懸浮液，距約尾尖1/3處進(jìn)針，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)報(bào)道確定注射細(xì)胞接種量，以每只0.2 mL將2.5×107個(gè)細(xì)胞/mL經(jīng)尾靜脈注入裸小鼠體內(nèi)。25～35 s內(nèi)完畢注射以防止動(dòng)物發(fā)生肺部栓塞死亡。

造模成功后，觀察動(dòng)物的一般生長(zhǎng)情況，且記錄模型的成瘤時(shí)間、成瘤時(shí)間、成瘤率、生存期等腫瘤一般生長(zhǎng)情況，同時(shí)利用小動(dòng)物成像儀，定期定量分析模型的體表區(qū)域的熒光表達(dá)情況以及發(fā)光強(qiáng)度。

1.3.6 原位癌模型的建立方法

將HCCLM3-Luc皮下瘤瘤源供體動(dòng)物(頸椎脫臼法)安樂死后，切取供體瘤源。瘤塊取下后置于4℃生理鹽水中輕柔地沖洗三遍去除血漬，同時(shí)用眼科剪刀和眼科鑷修飾瘤塊，將非活體腫瘤組織(外周的皮膚、肌肉、凋亡細(xì)胞或結(jié)締組織等)去除，挑選如新鮮魚肉樣、色澤明亮呈半透明樣的活性良好瘤塊作為移植手術(shù)瘤源，將其切成大小1 mm3的瘤塊小塊備用，受體動(dòng)物用小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)麻醉固定于手術(shù)操作臺(tái)上，使用碘伏和70%乙醇對(duì)上腹部手術(shù)區(qū)域皮膚進(jìn)行消毒處理后，在上腹部偏左肝的部位切開長(zhǎng)度約l cm的斜切口，將肝左側(cè)葉用無菌棉簽拖出腹腔暴露。使用顯微剪在肝左葉上做一個(gè)十字切開小切口，將供體的瘤塊用5-0縫合線縫合在肝上，迅速完成十字交叉縫合。用無菌棉棒將肝輕柔推回腹中，使用4-0帶針縫合線逐層縫合肌層和外皮，最后用紅霉素眼藥膏對(duì)創(chuàng)口進(jìn)行消炎處理，手術(shù)好的裸小鼠放于恒溫加熱墊上保溫，待其完全蘇醒后放回IVC籠盒內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HCCLM3-Luc細(xì)胞熒光酶表達(dá)情況測(cè)定性測(cè)定

將含有處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3-Luc細(xì)胞的黑色96孔板，置于Lumina Ⅱ活體成像暗室內(nèi)定量分析；在96孔細(xì)胞板中，檢測(cè)到含不同細(xì)胞數(shù)量HCCLM3-Luc的細(xì)胞孔均發(fā)出熒光表達(dá)不同強(qiáng)度的光點(diǎn)，說明HCCLM3細(xì)胞利用病毒轉(zhuǎn)染熒光素酶基因后細(xì)胞活力良好，基本保持了HCCLM3細(xì)胞株的生長(zhǎng)情況，并且體外增殖培養(yǎng)后，熒光表達(dá)強(qiáng)度穩(wěn)定，與細(xì)胞數(shù)量成正比例關(guān)系。

用高糖DMEM培養(yǎng)基將HCCLM3-Luc細(xì)胞在黑色的96孔板中進(jìn)行倍比稀釋，細(xì)胞數(shù)從2500個(gè)/孔至100 000個(gè)/孔，活體成像前15 min加入15 mg/kg熒光素底物，然后使用Living Image 4.2軟件檢測(cè)各孔的熒光值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和定量分析。

通過繪制標(biāo)記熒光素酶報(bào)告基因的腫瘤細(xì)胞數(shù)與生物發(fā)光光子量曲線圖(圖1A)，可得知發(fā)光強(qiáng)度與HCCLM3-Luc細(xì)胞數(shù)量有較好的線性關(guān)系(R2=0.9989，直線方程式為Y=1155.8X+ 1×106)，說明我們可以通過定量分析腫瘤細(xì)胞的光子量來推到出活體腫瘤的數(shù)量。

此實(shí)驗(yàn)最小檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量約為2500個(gè)/孔，平均ROI值約為每個(gè)細(xì)胞140光子/s，表明Luc熒光基因已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HCCLM3細(xì)胞株，說明了研究者定量分析體表的熒光值可以客觀全面地反映機(jī)體內(nèi)活體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況(圖1B)。

注：A：HCCLM3-luc細(xì)胞數(shù)與生物發(fā)光光子量曲線圖；B：HCCLM3-luc細(xì)胞體外生物發(fā)光成像。由圖可見，細(xì)胞數(shù)量與生物發(fā)光強(qiáng)度有線性關(guān)系。圖1 HCCLM3-luc生物發(fā)光成像Note. A, Curve of linear correlation between the HCCLM3-luc cell numbers and the fluorescence intensity of bioluminescence photons. B, Bioluminescence imaging of the HCCLM3-Luc cells in vitro. As shown in the figure, the bioluminescence intensity of cells was positively correlated with the number of cells.Figure 1 Bioluminescence imaging of the HCCLM3-Luc cells

2.2 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)接種1 mm3瘤塊原位癌模型的一般生長(zhǎng)情況

接種1 mm3瘤塊經(jīng)原位接種途徑造模，發(fā)現(xiàn)BALB/c-nu裸小鼠在第3天生物發(fā)光成像中，可觀察到裸小鼠腹部肝區(qū)域出現(xiàn)一塊明顯的生物成像光斑點(diǎn)，接種后7 d觀察裸小鼠腹部肝區(qū)域強(qiáng)發(fā)光點(diǎn)逐漸增強(qiáng)，并且向腹腔轉(zhuǎn)移趨勢(shì)，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)裸鼠的生物發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且在接種后21 d裸小鼠全腹腔皆出現(xiàn)全身廣泛的生物發(fā)光成像發(fā)光點(diǎn)，表示BALB/c-nu裸小鼠的原位移植癌模型通過接種瘤塊方式可模擬人類肝癌疾病模型的多種癥狀。如圖2所示。

注：A：HCCLM3-Luc細(xì)胞的肝原位癌接種腫瘤生長(zhǎng)曲線；接種后18 d，腫瘤組織的熒光值加速升高；B：BALB/c-nu裸鼠原位移植肝癌后腫瘤生長(zhǎng)情況的活體成像圖；在接種后18 d，裸鼠的腫瘤組織熒光值加速升高，并出現(xiàn)多處轉(zhuǎn)移灶。圖2 BALB/c-nu裸小鼠原位癌模型的生長(zhǎng)情況Note. A, Orthotopic inoculation tumor growth curve of HCCLM3-Luc cells. The bioluminescence intensity of the tumor tissues was significantly increased 18 days after inoculation. B, Bioluminescence imaging of orthotopic inoculation tumor growth. The bioluminescence intensity of tumor tissues of the nude mice was significantly increased and multiple metastases were found in the nude mice in different regions 18 days after inoculation.Figure 2 Growth conditions of the BALB/c-nu nude mouse model of orthotopic inoculation tumor

2.3 尾靜脈注射HCCLM3-Luc肝癌原位模型的構(gòu)建

尾靜脈途徑造模組的BALB/C-nu裸小鼠在第3天生物發(fā)光成像中，可觀察到裸小鼠體表區(qū)域有強(qiáng)烈的熒光表達(dá)情況，主要集中在兩肺區(qū)域，并且兩肺有兩塊強(qiáng)烈的發(fā)光的點(diǎn)，右肺光子量表達(dá)明顯地強(qiáng)于左肺，這現(xiàn)象符合腫瘤細(xì)胞血行播散的特點(diǎn)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，經(jīng)右心房、右心室、抵達(dá)肺的微小血管組織內(nèi)著床，因此，模型動(dòng)物早期體表兩肺區(qū)域有強(qiáng)的生物發(fā)光表達(dá)。

接種后7 d觀察到裸小鼠肺部強(qiáng)發(fā)光點(diǎn)逐漸減弱，并且有向腋窩，腹股溝部分轉(zhuǎn)移趨勢(shì)，接種后15 d僅出現(xiàn)腹部有明顯的生物成像發(fā)光點(diǎn)，最后接種后21 d裸小鼠皆出現(xiàn)全身廣泛的生物發(fā)光成像發(fā)光點(diǎn)，表示HCCLM3-Luc細(xì)胞株可能已經(jīng)全身通過血行，擴(kuò)散至動(dòng)物全身，可能出現(xiàn)肝、脾等器官轉(zhuǎn)移(圖3)。

結(jié)果顯示：通過尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞造模方式的肝癌原位模型成瘤率為(35.24 ± 11.36)%(根據(jù)體表區(qū)域熒光表達(dá)達(dá)到1×105為標(biāo)準(zhǔn))。造模第25天，全部6只模型動(dòng)物安樂死后，解剖取材時(shí)在裸鼠肝組織肉眼尚未可見有明顯的肝癌癌巢等肝病變表現(xiàn)，可見采用尾靜脈注射構(gòu)建肝癌原位癌模型時(shí)腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，不只是生成肝原位癌。

注：接種后約21 d，尾靜脈途徑造模組呈現(xiàn)全身轉(zhuǎn)移病灶。圖3 BALB/c-nu裸小鼠尾靜脈接種HCCLM3-Luc克隆細(xì)胞后腫瘤生長(zhǎng)情況的活體成像Note. Multiple metastases were found in the nude mice in different regions 21 days after injection with HCCLM3-Luc cell suspension through the tail vein.Figure 3 In vivo imaging of the tumor growth of HCCLM3-Luc clone cells intravenously injected into the BALB/c-nu nude mice through the tail vein

3 討論

近十年來，分子影像成像技術(shù)被廣泛運(yùn)用于腫瘤動(dòng)物模型研究。人們運(yùn)用分子影像技術(shù)可以直觀地、無創(chuàng)性檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)歸過程，并且為尋找有效的抗腫瘤新靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。

隨著高新科技的不斷出現(xiàn)，科研人員設(shè)想得到一種安全可靠的檢驗(yàn)手段，以期可早期診斷體內(nèi)腫瘤。光學(xué)成像具有眾多優(yōu)點(diǎn)[11]：靈敏度高、實(shí)時(shí)、非侵入、安全性好以及成像系統(tǒng)費(fèi)用相對(duì)較低，使得光學(xué)成像尤為適合小動(dòng)物腫瘤研究。一般常用的小動(dòng)物活體成像儀集合了X光檢測(cè)(X-ray inspection)、活體動(dòng)物熒光成像(fluorescence imaging，F(xiàn)LI)和生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging，BLI)三大功能模塊。熒光技術(shù)采用熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌等研究對(duì)象，而生物發(fā)光成像是用熒光素酶報(bào)告基因?qū)ζ溥M(jìn)行轉(zhuǎn)染[12]。利用精度靈敏的發(fā)光檢測(cè)儀，可以在活體內(nèi)直接動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活動(dòng)。同其他類型成像技術(shù)比較，生物發(fā)光成像以其高靈敏性、時(shí)效性高、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直觀、非放射性及費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，在短短的幾年時(shí)間內(nèi)，迅速地成為生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)技術(shù)[13]。

在本研究中，我們將熒光素酶基因轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HCCLM3，讓其在體外可穩(wěn)定表達(dá)熒光值，同時(shí)評(píng)價(jià)其發(fā)光能力。分別采用尾靜脈注射細(xì)胞懸液和原位癌接種瘤塊的方式，構(gòu)建人肝癌裸小鼠原位癌動(dòng)物模型，結(jié)合生物發(fā)光技術(shù)，在整體水平上運(yùn)用Lumina Ⅱ型活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織的生長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，成功地構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的人肝癌荷瘤裸小鼠模型，可為示蹤腫瘤生長(zhǎng)和評(píng)價(jià)中藥抗癌活性化合物的治療效果提供研究基礎(chǔ)。

在成功構(gòu)建的人肝癌裸小鼠原位癌動(dòng)物模型中，利用Lumina Ⅱ型小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)，可觀察到腫瘤的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光表達(dá)情況。而在傳統(tǒng)的荷瘤裸鼠模型中，皮下瘤通常采用測(cè)量瘤徑大小的方法檢查腫瘤的生長(zhǎng)情況，然而這種檢測(cè)方式在造模初期，無法觀測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。而對(duì)于普通的肝癌原位癌模型，需要借鑒超聲波技術(shù)檢測(cè)體內(nèi)腫瘤大小，這個(gè)增加了實(shí)驗(yàn)操作的難度。而本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的HCCLM3-Luc肝癌腫瘤模型在造模后第3天，就能測(cè)量到腫瘤細(xì)胞生物發(fā)光表達(dá)，且我們定量分析到腫瘤的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，隨著造模的時(shí)間增長(zhǎng)而不斷增強(qiáng)。因此利用生物發(fā)光成像技術(shù)追蹤腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生長(zhǎng)情況，不僅可以觀察到體外已經(jīng)成瘤的瘤塊，而且觀察到模型造模早期存有少量腫瘤細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，在腫瘤模型上具有一定的先進(jìn)性。

綜上，本章初步建立了穩(wěn)定表達(dá)熒光酶基因的人肝癌裸小鼠原位癌模型，通過優(yōu)化原位癌模型的種植部位和體積數(shù)量，并且優(yōu)選了人肝癌裸小鼠原位癌的構(gòu)建方法，采用肝葉移植腫瘤組織，通過條件優(yōu)化，目前成功率高達(dá)(75.2 ± 7.2)%。該動(dòng)物模型具備高成瘤率、操作方法重復(fù)性高、手術(shù)技術(shù)要求低、造模時(shí)間短，可客觀真實(shí)地監(jiān)測(cè)腫瘤組織生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，該動(dòng)物模型可用于中藥抗腫瘤活性成分的篩選。