過(guò)表達(dá)JAZF1對(duì)甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

熊代剛，侯澤宇，蔡玉懷，黃亮亮，楊 艷，曾 峰，程曉明*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺疾病診療中心，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563000)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是目前最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，近年來(lái)其在全球的發(fā)病率持續(xù)上升，TC病理分型主要包括分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma, DTC)、未分化型甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer, ATC)、髓樣癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)，其中乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)屬于分化型甲狀腺癌，是目前臨床上最常見(jiàn)的類型，多數(shù)預(yù)后較好，但仍有部分患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差。隨著對(duì)甲狀腺癌分子發(fā)病機(jī)制的深入研究，癌基因擴(kuò)增或抑癌基因表達(dá)或功能障礙在TC發(fā)病中的不斷認(rèn)識(shí)，更多關(guān)于TC分子診斷、靶向治療的分子研究被關(guān)注。JAZF1(juxtaposed with another zinc finger protein 1)又名孤兒核受體TAK1相互作用蛋白27(TAK1-interacting protein 27，Tip27)，研究報(bào)道JAZF1參與子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤[1, 2]、前列腺癌[3]、非HBV及非HCV相關(guān)肝細(xì)胞癌[4]的進(jìn)展，可能是抑癌基因。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)JAZF1在甲狀腺癌組織中表達(dá)相對(duì)良性甲狀腺結(jié)節(jié)、癌旁組織明顯下調(diào)，提示JAZF1可能參與了TC的發(fā)展，但具體機(jī)制不清楚。本研究將在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞BCPAP中過(guò)表達(dá)JAZF1，探討JAZF1對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖、凋亡的生物學(xué)作用及可能機(jī)制，從而為PTC的分子靶向治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細(xì)胞購(gòu)自中科院上海干細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(FBS)、RPMI 1640、非必需氨基酸(NEAA)、丙酮酸鈉、谷氨酰胺購(gòu)至Gibco公司；RNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑購(gòu)自TaKaRa公司；GAPDH購(gòu)自華安生物技術(shù)有限公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt購(gòu)自CST公司；全蛋白提取試劑盒、MTT試劑盒購(gòu)自索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自雅酶生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物。FACSAria II流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

BCPAP細(xì)胞采用含10% FBS、1% NEAA、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基、置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第6代且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，Adv-GFP、Adv-JAZF1-GFP分別感染BCPAP細(xì)胞，分為陰性對(duì)照組、空載組(Adv-GFP)、實(shí)驗(yàn)組(Adv-JAZF1-GFP)，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液并接種于96孔板，每孔細(xì)胞懸液103個(gè)/200 μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)染Adv-GFP/Adv-JAZF1-GFP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，各時(shí)間點(diǎn)吸去上清，加入90 μL新鮮完全培養(yǎng)基，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄上清，各孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔吸光度值，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照組，每組設(shè)定至少3個(gè)復(fù)孔。

1.3.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，調(diào)整每皿細(xì)胞數(shù)為103個(gè)，每皿加入3 mL細(xì)胞完全培養(yǎng)基，混勻使細(xì)胞分布均勻靜置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換一次液，14 d后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆，棄培養(yǎng)基后固定15 min，染色20 min，PBS漂洗3次，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，并根據(jù)公式：克隆形成效率=克隆數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量 × 100%，分別計(jì)算各組細(xì)胞克隆形成效率。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染后48 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500 μL的binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL的annexin V-FITC混勻后，加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide)，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR-Green I法、ABI 7500、qRT-PCR二步法檢測(cè)JAZF1 mRNA的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，用2-△△CT值表示基因相對(duì)表達(dá)量。所用引物：GAPDH：上游5’-GGAGCGAGATC CCTCCAAAAT-3’，下游5’-GGCTGTTGTCATACTT CTCATGG-3’;JAZF1：上游5’-CACGCCACAGCAG TGGAAGC-3’,下游5’-AGCAGTGGAAGCCTTACT CC-3’。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，采用全蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量各蛋白濃度，調(diào)整各蛋白濃度使電泳時(shí)上樣量與體積一致，蛋白變性后，每個(gè)泳道上樣量20 μg，10% SDS-PAGE電泳并4℃濕轉(zhuǎn)過(guò)夜，封閉、洗膜、一抗(Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt)4℃孵育過(guò)夜、洗膜、二抗室溫孵育1 h，洗膜并顯色成像，以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J軟件比較條帶灰度值與灰度比即半定量各蛋白質(zhì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 JAZF1在BCPAP細(xì)胞中形成過(guò)表達(dá)

Adv-GFP、Adv-JAZF1-GFP轉(zhuǎn)染BPCPA細(xì)胞48 h后，NC組與空載組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)組JAZF1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較NC組、空載組明顯上調(diào)(mRNA：P<0.001；蛋白：P<0.001)，見(jiàn)圖1。

2.2 過(guò)表達(dá)的JAZF1對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖及集落形成能力的影響

MTT結(jié)果提示過(guò)表達(dá)的JAZF1在24 h、48 h、72 h明顯抑制BCPAP細(xì)胞增殖(均P<0.01)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組克隆形成效率較NC組、空載組明顯降低(均P<0.001)，見(jiàn)圖2。

注：與NC組相比，***P<0.001。圖1 qRT-PCR、Western blot檢測(cè)各組BCPAP細(xì)胞JAZF1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)水平Note. Compared with the negative control group,***P<0.001.Figure 1 Relative expression levels of JAZF1 and JAZF1 mRNA in each group of BCPAP cells assessed by qRT-PCR and Western blot assay

2.3 上調(diào)JAZF1對(duì)BCPAP細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較NC組、空載組明顯增加(23.02±0.35%vs. 8.63±0.40%, 7.95±0.32%，均P<0.001)，見(jiàn)圖3。

2.4 過(guò)表達(dá)的JAZF1對(duì)Bcl-2/Bax信號(hào)通路的調(diào)控作用

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下調(diào),較NC組降低了66.0%(P<0.001)，Bax相對(duì)蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，較NC組增加了64.8%(P<0.001)，NC組與Adv-GFP組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)見(jiàn)圖4。

2.5 過(guò)表達(dá)的JAZF1對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的JAZF1抑制BCPAP細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)水平(均P<0.001)，能明顯下調(diào)p-PI3K/t-PI3K、pAkt/t-Akt的比值(P<0.001)，見(jiàn)圖5。

注：與NC組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖2 JAZF1過(guò)表達(dá)對(duì)各組BCPAP細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響Note. Compared with the negative control group, **P<0.01, ***P<0.001.Figure 2 Effect of JAZF1 overexpression on the proliferation and clone formation of BCPAP cells in each group

圖3 JAZF1過(guò)表達(dá)對(duì)各組BCPAP細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of JAZF1 overexpression on apoptosis in the BCPAP cells in each group

注：與NC組相比，***P<0.001。圖4 過(guò)表達(dá)的JAZF1對(duì)Bcl-2/Bax信號(hào)通路的影響Note. Compared with the negative control group,***P<0.001.Figure 4 Effect of JAZF1 overexpression on the Bcl-2/Bax signaling pathway

注：與NC組相比，***P<0.001。圖5 過(guò)表達(dá)的JAZF1對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響Note. Compared with the negative control group,***P<0.001.Figure 5 Effect of JAZF1 overexpression on the PI3K/Akt signaling pathway

3 討論

JAZF1是核孤兒受體TAK1的競(jìng)爭(zhēng)抑制因子，包含三個(gè)假定的鋅指基序和一個(gè)富含谷氨酸/天冬氨酸的區(qū)域，研究推測(cè)JAZF1中鋅指結(jié)構(gòu)域和富含谷氨酸/天冬氨酸的區(qū)域可能在TAK1-JAZF1復(fù)合物募集其他核蛋白中起作用[6]。既往研究表明JAZF1調(diào)控糖、脂代謝[7]、胰島素抵抗[8]，其變異體參與前列腺癌、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤的發(fā)生與發(fā)展。由于TAK1的轉(zhuǎn)錄活性依賴于細(xì)胞類型，可能存在正調(diào)控或負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄作用，因此，作為TAK1競(jìng)爭(zhēng)抑制因子的JAZF1可能在不同的細(xì)胞中表現(xiàn)不同的生物學(xué)效應(yīng)。Bae等[9]研究表明過(guò)表達(dá)的JAZF1可以通過(guò)上調(diào)促凋亡基因誘導(dǎo)心肌細(xì)胞心力衰竭癥狀。Yuasa等[10]研究認(rèn)為過(guò)表達(dá)JAZF1能促進(jìn)C2C12細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖。

基于本課題的前期研究提示：JAZF1可能在甲狀腺癌的進(jìn)程中可能發(fā)揮抑制作用，為進(jìn)一步明確其生物學(xué)功能，本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)的JAZF1對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞BCPAP的增殖活性的影響，結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)的JAZF1隨時(shí)間明顯抑制了BCPAP細(xì)胞的增殖(均P<0.01)；同時(shí)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)的JAZF1明顯抑制BCPAP細(xì)胞的克隆形成(均P<0.001)，即JAZF1抑制了BCPAP細(xì)胞群體依賴性及細(xì)胞增殖能力。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞重要的生物學(xué)現(xiàn)象，且是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程。Bcl-2蛋白家族是通過(guò)控制線粒體通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，因其Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域分為三個(gè)亞家族：抗凋亡蛋白如Bcl-2、僅含BH3的促凋亡蛋白如BAD、孔隙形成促凋亡蛋白如Bax[11]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)的JAZF1促進(jìn)了BCPAP細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步探討JAZF1對(duì)BCPAP促凋亡的相關(guān)機(jī)制，Western blot結(jié)果證實(shí)了上調(diào)的JAZF1抑制了Bcl-2、增強(qiáng)了Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K /AKT)信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、蛋白質(zhì)合成、凋亡和代謝過(guò)程中最關(guān)鍵的分子信號(hào)通路之一[12]，全基因組測(cè)序研究也表明PI3K信號(hào)通路是甲狀腺腫瘤發(fā)生的主要激活途徑之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)TC中PI3K、Akt發(fā)生遺傳學(xué)改變，導(dǎo)致其表達(dá)量異常增加且信號(hào)通路呈過(guò)度激活狀態(tài)[13-15]。在本研究中，上調(diào)的JAZF1能抑制p-PI3K和p-Akt表達(dá)，顯著降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的比值，表明過(guò)表達(dá)的JAZF1能抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，這也可能是抑制BCPAP細(xì)胞增殖和凋亡的可能機(jī)制。

綜上所述，過(guò)表達(dá)的JAZF1能有效抑制BCPAP細(xì)胞增殖及克隆形成，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能與Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號(hào)通路活性改變有關(guān)，這將可能為抑制PTC的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。