流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠技術(shù)檢測(cè)O型孕婦IgG anti-A(B)相關(guān)性分析及臨床意義

唐宗生,汪 沁,陶雨琦,陶明芬

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院 1.輸血科；2.血液凈化中心，安徽 蕪湖241001)

新生兒溶血癥(Haemolytic disease of the newborn，HDN)是一種因母嬰血型不合，母親體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)胎兒紅細(xì)胞上相應(yīng)抗原的IgG抗體，IgG抗體通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，從而導(dǎo)致胎兒發(fā)生溶血的疾病。如沒(méi)有進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，HDN可導(dǎo)致胎兒發(fā)生黃疸、貧血、水腫，嚴(yán)重的可導(dǎo)致膽紅素腦病，甚至死亡[1]。

HDN嚴(yán)重影響胎兒的健康，在生產(chǎn)前及時(shí)檢測(cè)母親血清的抗體效價(jià)有助于評(píng)估HDN發(fā)生的可能性及危害程度[2]，臨床可根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果及時(shí)進(jìn)行處理，減輕HDN對(duì)胎兒的危害。目前絕大多數(shù)醫(yī)院對(duì)母親血清抗體效價(jià)的檢測(cè)采用的是微柱凝膠法，該方法屬于半定量方法，其數(shù)值穩(wěn)定性欠佳，檢驗(yàn)結(jié)果可受諸多因素影響[3]，難以滿足臨床的要求。

流式細(xì)胞術(shù)是一種可快速測(cè)定細(xì)胞熒光含量的新興方法，該方法屬于定量方法，其結(jié)果客觀、穩(wěn)定，有利于得到準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果[4]。目前流式細(xì)胞術(shù)用于產(chǎn)前測(cè)定孕婦血清IgG anti-A(B)的可行性及方法學(xué)研究很少有文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究以微柱凝膠法為標(biāo)準(zhǔn)，在摸索中建立了一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)孕婦IgG anti-A(B)的實(shí)驗(yàn)方法，即利用抗人IgG熒光抗體測(cè)定結(jié)合在紅細(xì)胞血型抗原上的IgG抗A(B),研究流式細(xì)胞術(shù)用于定量檢測(cè)孕婦IgG anti-A(B)可行性，并比較流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠法的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取在我院門(mén)診產(chǎn)檢的O型孕婦27例，年齡22-37歲，其丈夫血型為：A型(13例)、B型(10例)和AB型(4例)。用EDTA-K2抗凝管采集孕婦外周靜脈血。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器

鼠 Anti-human IgG-FITC(美國(guó)BD公司)、流式染色Buffer(美國(guó)R&D公司)、β-巰基乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)卡(長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、37℃專(zhuān)用孵育器及卡式離心機(jī)(長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、 FC500 MPL流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

1.3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)敢褐苽浜湍敢合♂?取O型孕婦血漿和β-巰基乙醇各200 μl，混勻，37℃水浴40 min，滅活I(lǐng)gM抗體，最終制成母液；生理鹽水倍比稀釋母液為： 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024。然后分別用微柱凝膠卡式法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度稀釋液IgG anti-A(B)。流式細(xì)胞術(shù)需同時(shí)檢測(cè)母液的IgG anti-A(B)。

1.3.2微柱凝膠抗人球蛋白試驗(yàn) 向微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)卡各微孔中加入50 μl 1%紅細(xì)胞懸液和50 μl不同稀釋倍數(shù)的滅活血漿。將卡置于37℃專(zhuān)用孵育器內(nèi)孵育30 min后，離心5 min (900 rpm 2 min，1500 rpm 3 min)，取出，觀察結(jié)果。以微孔中紅細(xì)胞在凝膠中開(kāi)始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象的前一管所加稀釋液的倍數(shù)作為IgG anti-A(B)效價(jià)。

1.3.3流式細(xì)胞檢測(cè) 設(shè)立1管同型對(duì)照管和不同稀釋倍數(shù)(包括母液)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)管。在流式管中加50 μl 1%紅細(xì)胞懸液和50 μl滅活血漿(同型對(duì)照管以生理鹽水替代血漿)，試管振蕩混勻，水浴30 min；2 ml 0.9% 生理鹽水洗滌細(xì)胞2次(1500 rpm 3 min)，棄上清；加500流式染色Buffer洗滌細(xì)胞1次(1500 rpm 3 min)，棄上清；每管加入鼠 Anti-human IgG-FITC 2 μl，進(jìn)行染色，避光反應(yīng)30 min；再用FBS洗滌2次(1500 rpm 3 min)，棄上清；每管加700 μl流式染色Buffer后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(每份樣本收集10000個(gè)細(xì)胞用作流式細(xì)胞分析。)。

1.4 結(jié)果分析

Flowjo(7.6，美國(guó))流式軟件用作分析流式細(xì)胞儀采集的數(shù)據(jù)；Graphpad prism(6.0，美國(guó))軟件用作實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析；非參數(shù)Spearman correlation檢驗(yàn)用于數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析； One-Way ANOVA用于組與組之間的差別檢驗(yàn)；α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 研究流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠卡式法檢測(cè)ABO血型IgG抗體結(jié)果存在相關(guān)性

圖1A流式圖由前向角散射 (FSC)和側(cè)向角散射 (SSC)構(gòu)成的散點(diǎn)圖與兩個(gè)Anti-human IgG-FITC通道(流式FL1)直方圖構(gòu)成。在散點(diǎn)圖所示紅細(xì)胞群外周畫(huà)“門(mén)”，在紅細(xì)胞“門(mén)”內(nèi)以Anti-human IgG-FITC通道作兩個(gè)直方圖：同型對(duì)照和實(shí)驗(yàn)對(duì)照。在兩個(gè)直方圖上分別畫(huà)兩個(gè)線性“門(mén)”，用以檢測(cè)IgG anti-A(B) 總MFI 和IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率；孕婦IgG anti-A(B) 效價(jià)分別與母液IgG anti-A(B) 總MFI 和IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率成正相關(guān)(r=0.4726,P=0.0073;r=0.6158,P=0.0002)，見(jiàn)圖1B和圖1C；同時(shí)母液IgG anti-A(B) 總MFI 和IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率成正相關(guān)(r=0.9185,P<0.0001)，見(jiàn)圖1D。

圖1 IgG anti-A(B) 效價(jià)與母液流式結(jié)果的相關(guān)性

2.2 血型型別(A或B)對(duì)流式結(jié)果之間的相關(guān)性的影響

按血型分組，不管是A型，還是B型，單純母液IgG anti-A(B)總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率均成正相關(guān)(r=0.9020,P<0.0001;r=0.9043,P<0.0001)，見(jiàn)圖2A和圖2B；另外，按血型分組，不管是A型，還是B型，不同稀釋倍數(shù)的稀釋管IgG anti-A(B) 總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率均成正相關(guān)(r=0.8913,P<0.0001;r=0.8706,P<0.0001)，見(jiàn)圖2C和圖2D。

2.3 母液IgG anti-A(B)總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率ROC曲線面積分析

以微柱凝膠卡式法結(jié)果正常參考值1∶64作Cutoff值，分別將母液IgG anti-A(B)總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率分為兩組：<64組和≥64組，從而畫(huà)出IgG anti-A(B)總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率ROC曲線。相比于IgG anti-A(B)總 MFI(Area=0.7405,P=0.03289)，IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率有更大的曲線面積(Area=0.8238,P=0.0041)，見(jiàn)圖3A。

圖2 血型型別(A或B)對(duì)流式結(jié)果之間的相關(guān)性的影響

圖3 母液IgG anti-A(B)總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率ROC

2.4 流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠卡式法檢測(cè)ABO血型IgG抗體靈敏性分析

圖4A表示孕婦IgG anti-A(B)效價(jià)是1∶64時(shí)，其流式稀釋管1∶64、1∶128和1∶256的IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率的直方圖；孕婦IgG anti-A(B)效價(jià)與其對(duì)應(yīng)流式稀釋管IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率成反相關(guān)(r=-0.4026,P=0.0247)，見(jiàn)圖4B；孕婦IgG anti-A(B)效價(jià)是1∶64時(shí)，其流式稀釋管1∶64和1∶128的IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率有顯著差異(P=0.0044)，但稀釋管1∶128和1∶256的IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率之間無(wú)顯著差異(P>0.9999)見(jiàn)圖4C。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠卡式法檢測(cè)ABO血型IgG抗體靈敏性

3 討論

由于HDN對(duì)胎兒的危害巨大，因此給臨床提供母體血清抗體效價(jià)的準(zhǔn)確結(jié)果十分必要。目前我院對(duì)母體血清抗體效價(jià)的檢測(cè)采用的是微柱凝膠法，該法與傳統(tǒng)的試管法相比有巨大的進(jìn)步，其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀，尤其方便大批量標(biāo)本的檢驗(yàn)。但這種方法屬于半定量，其結(jié)果不夠準(zhǔn)確、不夠穩(wěn)定[5,6]，與臨床要求存在很大差距。

我們的結(jié)果證實(shí)微柱凝膠技術(shù)孕婦IgG anti-A(B) 效價(jià)分別與流式細(xì)胞術(shù)母液IgG anti-A(B) 總MFI 和IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率成正相關(guān)(r=0.4726,P=0.0073;r=0.6158,P=0.0002)，且流式母液IgG anti-A(B) 總MFI 和IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率有很好的相關(guān)性(r=0.9185,P<0.0001),這與楊樹(shù)法[7]和Kang SJ[8]等人的結(jié)果基本相符。表明流式細(xì)胞術(shù)母液IgG anti-A(B) 總MFI 或IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率夠均能替代微柱凝膠技術(shù)檢測(cè)O型孕婦IgG anti-A(B) 效價(jià)，且無(wú)須進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)@得定量結(jié)果。

在我們的研究中，流式細(xì)胞術(shù)按血型分組，不管是A型或B型，也不管是母液或稀釋液管，IgG anti-A(B)總 MFI和IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率均成正相關(guān)(r=0.9020,P<0.0001;r=0.9043,P<0.0001)(r=0.8913,P<0.0001;r=0.8706,P<0.0001)。表明流式細(xì)胞術(shù)替代微柱凝膠技術(shù)檢測(cè)O型孕婦IgG anti-A(B) 效價(jià)不受血型型別(A或B型)的影響。

目前臨床普遍以抗體效價(jià)是否大于1∶64來(lái)判斷是否有臨床意義[9,10]。因此，我們以微柱凝膠技術(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，取正常參考值1∶64作Cutoff值，得到流式母液管IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率受試者工作曲線(ROC)面積(Area=0.8238,P=0.0041)大于IgG anti-A(B)總 MFI的ROC面積(Area=0.7405,P=0.03289)。這個(gè)結(jié)果表明：在流式檢中，同IgG anti-A(B)總 MFI相比， 用IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率表示孕婦IgG anti-A(B)結(jié)果，能獲得更好的靈敏度和特異度。

既往研究表明1個(gè)IgG分子上有近百個(gè)賴(lài)氨酸殘基[11]，至少能標(biāo)記上 15～20個(gè)熒光基團(tuán)[12]，一個(gè)紅細(xì)胞只要結(jié)合數(shù)個(gè)IgG分子，就能通過(guò)流式細(xì)胞儀分辨出來(lái)[13]，所以流式細(xì)胞術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)比微柱凝膠法高，我們的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。孕婦IgG anti-A(B)效價(jià)與其對(duì)應(yīng)流式稀釋管IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率成反相關(guān)(r=-0.4026,P=0.0247),且孕婦IgG anti-A(B)效價(jià)是1∶64時(shí)，其流式稀釋管1∶64和1∶128的IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率有顯著差異(P=0.0044)，但稀釋管1∶128和1∶256的IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率之間無(wú)顯著差異(P>0.9999)。這表明，相對(duì)于微柱凝膠法，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IgG anti-A(B)陽(yáng)性百分率敏感性更高，但當(dāng)血清被稀釋到極低濃度時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)也無(wú)法作進(jìn)一步區(qū)分。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠技術(shù)均是檢測(cè)O型孕婦IgG anti-A(B)較好的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。我們的研究表明，流式細(xì)胞術(shù)與微柱凝膠技術(shù)兩種方法檢測(cè)孕婦IgG anti-A(B)的結(jié)果存在相關(guān)性，母液IgG anti-A(B) 陽(yáng)性百分率能高靈敏、高特異地判斷母體血清抗體效價(jià)是否大于1∶64。盡管流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)孕婦O型孕婦IgG anti-A(B)所涉及的熒光抗體昂貴，且對(duì)儀器操作者操作技術(shù)及能力有較高要求，但相對(duì)于微柱凝膠技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IgG anti-A(B)方法可以定量檢測(cè)，且方法更簡(jiǎn)單、效率更高、敏感性更好，值得臨床進(jìn)一步推廣。