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    基于SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選乳腺癌血清蛋白標(biāo)志物

    2019-09-27 01:21:38孫亞冬王家祥崔樹德
    中國實驗診斷學(xué) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:載脂蛋白質(zhì)譜陰性

    孫亞冬,王家祥,崔樹德*

    (鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.乳腺科;2.外科,河南 鄭州450008)

    乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤,死亡率僅次于肺癌為第二位[1]。乳腺癌的預(yù)后與疾病分期及生物分型密切相關(guān),目前早期診斷仍然是治愈的關(guān)鍵[2],如何尋找敏感性高、特異性高并且可以用于早期診斷和篩查的生物指標(biāo),發(fā)現(xiàn)尚處于亞臨床病變階段的腫瘤對臨床意義重大[3,4]。本研究通過收集乳腺癌患者和正常健康女性的血清標(biāo)本,應(yīng)用表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù),分別研究乳腺癌術(shù)前組與健康對照組、乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組、三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組之間血清蛋白質(zhì)譜的變化特征,以期尋找到相關(guān)的血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物,進而對于乳腺癌的早期診斷、療效評價及不同亞型的預(yù)后分析提供一定幫助。然后聯(lián)合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE和Western blot 等多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對篩選出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進行鑒定和驗證,最終確定乳腺癌血清特異蛋白標(biāo)記物,從而為乳腺癌的早期診斷及三陰性乳腺癌的潛在靶點尋找依據(jù)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 血清樣本收集與處理

    收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院女性乳腺癌患者資料總計60例,時間自2011年06月至2014年6月,其年齡范圍為23-70歲,平均年齡為46.7+0.4歲,病理明確診斷為乳腺癌,所有患者入組前未接受治療,診斷明確后均接受手術(shù)治療,術(shù)后規(guī)范接受化療、放療或內(nèi)分泌治療。其中確診為三陰性乳腺癌的患者占22例。同時收集健康女性的血清樣本20例,設(shè)為健康對照組。所有參與實驗的患者及健康對照者,都已了解相關(guān)內(nèi)容,并征得知情同意。

    入組乳腺癌患者術(shù)前、對應(yīng)術(shù)后2周的標(biāo)本,兩組均為60例。所有患者均在清晨06:30-7:30抽血留取標(biāo)本,要求空腹?fàn)顟B(tài),標(biāo)本于室溫下靜置0.5-1 h,然后放入離心機進行離心,轉(zhuǎn)速3 000 r/min,離心時間20-30 min,離心后標(biāo)本抽取上清液至EP管,做好標(biāo)記后放入-80℃冰箱保存。

    1.2 儀器和設(shè)備

    SELDI-TOF-MS、96孔蛋白芯片(Bioprocessor)、SELDI芯片、WCX芯片、CHAPS(3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸)、乙腈(Acetonitrile)、DTT(1,4-二硫代蘇糖醇)、TEMED(四甲基乙二胺)均購于美國Ciphergen公司,MALDI-TOF-MS購于英國Kratos Analytical公司,真空冷卻離心濃縮系統(tǒng)(SPD SpeedVac)購于美國Thermo Electron Inc公司,胰蛋白酶(Trypsase)于美國Promega Inc公司。

    1.3 方法

    1.3.1血清樣本的處理 解凍血清標(biāo)本,室溫下溶解,然后離心(4℃,10 000 r/min),將離心后的樣本加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入5 μl樣本,然后加入10 μl U9緩沖液,并加入1% Bar、2%CHAPS各10 μl,放入4℃層析柜內(nèi),振蕩大約30 min,500 r/min。

    1.3.2SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選血清樣本 將芯片裝入加樣器Bioprocessor中,每孔中加入NaAC(100 mmol/L,pH4)200 μl,放入層析柜中,以600 r/min振蕩2 min,然后重復(fù)上述操作過程1次。將經(jīng)過U9處理后的96孔板Bioprocessor置于冰盒上,加入NaAC185 μl,這一步驟使用排槍操作,然后再次放入層析柜中,4℃條件下,600 r/min震蕩2 min。在蛋白質(zhì)芯片上加入已處理的樣本100 μl,放置于層析柜中,4℃條件下,600 r/min結(jié)合60 min,然后甩去殘液,快速拍干。加入NaAC200 μl,600 r/min振蕩5 min后,方法同前,以上操作重復(fù)3次。使用200μl去離子水將各孔沖洗兩次,仔細(xì)甩干,將芯片風(fēng)干,每孔加入50%飽和的SPA 1 μl,分兩次進行,等待芯片干燥后上機。設(shè)置參數(shù)如下:分子量范圍為2000Da-20000Da,最高分子量為30000Da,使用Ciphergen Biosystems 軟件(3.1版)校正原始試驗數(shù)據(jù),使數(shù)據(jù)的總離子強度和分子量實現(xiàn)均一化;使用Biomarker Wizard軟件包和ZUCI-ProteinChip Data軟件包來過濾噪音和去除基線。并檢測儀器的運行情況及靈敏度,然后把裝有檢測樣本的蛋白質(zhì)芯片板放入質(zhì)譜儀中,通過MELDI-TOF-MS系統(tǒng),進行數(shù)據(jù)收集,并應(yīng)用相應(yīng)軟件對數(shù)據(jù)進行處理,分別獲取到各個樣本的m/z峰(質(zhì)/荷比),數(shù)據(jù)中差異性<0.3% 的被認(rèn)為是同一種蛋白質(zhì)。

    1.3.3乳腺癌血清中特異性蛋白質(zhì)的鑒定 根據(jù)SELDI-TOF-MS篩選出的乳腺癌特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,即(m/z)位于6448的蛋白質(zhì)或肽段,選取6448的蛋白質(zhì)或肽段峰值高表達(dá)的血清樣本進行純化及鑒定。對樣本進行篩選后制備凝膠,收集乳腺癌組樣品血清2 ml,然后加入超純水,稀釋至5 ml,再進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分離,步驟如下:把兩塊玻璃板(厚度為0.75 mm)清洗干凈,夾緊固定于膠架上,先后加入分離膠和濃縮膠,需要等待膠體完全凝固后進行上樣,將5 μl指示劑加入到前期處理后的樣本中,沸水浸泡,約15-20 min,取出,然后5000 r/min離心,時間5 min,然后取上清液10 μl,小心加至膠體梳齒槽中,將Marker加入第一槽作為參照。然后將初始電壓設(shè)為30 v,待樣本電泳到濃縮膠與分離膠的分界處時,調(diào)至電壓為100 v,繼續(xù)電泳4-6 h小時以后,等待指示劑接近膠體底部的時候,關(guān)掉電源,取出玻板,將濃縮膠和分離膠進行分離,濃縮膠進行移除,仔細(xì)分離分離膠并放入清潔培養(yǎng)皿中進行考馬斯亮蘭染色,染色時間為6-8小時。將染色成功后的分離膠進行切取,用標(biāo)記好的EP管分裝。參照膠內(nèi)酶解試劑盒的說明書,經(jīng)酶解得到目標(biāo)蛋白。向樣本中加入提取液,然后對上清液進行提取,將基質(zhì)添加至上清液后,在蛋白質(zhì)芯片板上進行點樣,然后放入MALDI-TOF/TOF中,經(jīng)過激光轟擊,肽段序列進行收集,然后利用Mascot軟件,繼而與Swiss Prot數(shù)據(jù)庫連接、進行匹配和比對,最終得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進行處理,通常通過噪音過濾和聚類分析,對篩選出的m/z峰進行統(tǒng)計學(xué)檢驗,采用Wilcoxon秩和檢驗,并對不同實驗組質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行t檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.01。

    2 結(jié)果

    2.1 乳腺癌組與健康對照組間的比較

    將乳腺癌組與健康對照組之間的蛋白質(zhì)譜進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,再進行聚類分析,得到兩組各自的差異蛋白峰值,然后對兩組蛋白峰值進行Wilcoxon秩和檢驗,共收集到14個具有差異性的蛋白峰值(P<0.01),其中有11個在乳腺癌組呈高表達(dá),3個在乳腺癌組呈低表達(dá)。通過SVM回歸,篩選出其中Youden指數(shù)最高的模型,差異蛋白峰為定位于6448的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,與健康人群相比,在乳腺癌患者中,m/z峰定位于6448的蛋白標(biāo)記物低表達(dá)。其在乳腺癌組低表達(dá)強度為38.0187±34.2194,而在正常組高表達(dá),表達(dá)強度為337.5261±507.6438,差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(圖1、2)。

    圖1 m/z 6448 在各組中的對比質(zhì)譜圖(0為正常組,1為乳腺癌組)

    圖2 m/z 6448 在不同組中的模擬電泳圖,紅色條帶處(0為正常組,1為術(shù)前組)

    2.2 乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組間的比較結(jié)果

    對乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組進行質(zhì)譜分析,得到具有差異性的蛋白質(zhì)峰值(P<0.01),共篩選出6個,其中有4個在乳腺癌術(shù)前組呈高表達(dá),2個低表達(dá)。通過支持向量機(SVM),將Youden指數(shù)最高的模型篩選出來,最終得到m/z峰位于6448的蛋白標(biāo)記物,其在術(shù)前組表達(dá)強度為38.0187±34.2194,術(shù)后組表達(dá)強度為294.1245±102.8634,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3、4)。

    2.3 三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組的比較結(jié)果

    采用SELDI-TOF-MS技術(shù)平臺對三陰性乳腺組與非三陰性乳腺癌組進行質(zhì)譜分析,得到具有差異性的蛋白質(zhì)峰值(P<0.01),共篩選出9個,其中有4個在三陰性乳腺癌組低表達(dá)。通過SVM篩選出Youden指數(shù)最高的模型,也可以得到m/z峰位于6448的蛋白標(biāo)記物,其在三陰性乳腺癌中表達(dá)強度為5.1351+3.6437,非三陰性乳腺癌組表達(dá)強度為43.6162±18.8542,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000163,<0.01)(圖5、6)。

    圖3 m/z 6448在各組中的對比質(zhì)譜圖(0為乳腺癌術(shù)前組,1為術(shù)后組)

    圖4(m/z) 6448在不同組中的模擬電泳圖,紅色條帶處(0為術(shù)前組,1為術(shù)后組)

    圖6 m/z 6448在不同組中的模擬電泳圖,紅色條帶處(0為非三陰性乳腺癌組,1為三陰性乳腺癌組)

    2.4 特異性蛋白質(zhì)的鑒定

    以Marker所提供的分子量作為參照標(biāo)尺,切取相對應(yīng)的分子量軸上目標(biāo)蛋白條帶,然后進行酶解離心,再取上清液,使用MALDI-TOF/TOF技術(shù)獲取到肽段混合物并對其進行檢測鑒定。結(jié)果顯示,含有m/z6448的純化液經(jīng)過檢測得到的蛋白片段(表1),將檢測出的m/z為6448Da的蛋白質(zhì)肽段樣品進行酶解,然后通過MALDI-TOF/TOF系統(tǒng)進行肽段檢測。m/z為6448 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為:LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK,將肽段導(dǎo)入SEQUEST檢索程序并在Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索,此肽段為載脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,APO C-I)。圖7為鑒定m/z為6448Da的蛋白質(zhì)或肽段酶解的部分肽段的質(zhì)譜圖。

    表1 質(zhì)荷比為6448Da的蛋白質(zhì)或肽段及其酶解后的肽段序列

    圖7 鑒定質(zhì)荷比為6448Da的蛋白質(zhì)或肽段酶解的部分肽段質(zhì)譜圖

    3 討論

    本研究通過SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選出質(zhì)荷比(m/z)為6448的蛋白質(zhì)峰,然后聯(lián)合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE等技術(shù)對篩選出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進行鑒定和驗證,質(zhì)荷比6448蛋白質(zhì)為載脂蛋白C-I肽段(ApoC-I)。同時發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-I肽段在乳腺癌患者血清中明顯降低,顯著低于健康對照人群;而患者術(shù)后血清中載脂蛋白C-I肽段有上升趨勢;在三陰性乳腺癌組表達(dá)低于非三陰性乳腺癌組。這一結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)了可以用于乳腺癌早期診斷和檢測預(yù)后的新型生物指標(biāo),而且提示我們載脂蛋白ApoC-I肽段對乳腺癌有一定的保護性作用,載脂蛋白ApoC-I肽段與腫瘤細(xì)胞增殖分化可能呈負(fù)相關(guān)。因為我們看到作為乳腺癌亞組中惡性程度最高、侵襲性最強、轉(zhuǎn)移能力最強的三陰性乳腺癌組,這一蛋白質(zhì)肽段的表達(dá)更低,它的生物學(xué)作用和機制需要進一步探索。

    三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%-20%,是乳腺癌所有分子分型里預(yù)后最差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險最高的一種亞型,因為缺乏有效的治療手段,僅僅對化療敏感,內(nèi)分泌治療和分子靶向治療均不敏感,因此,三陰性乳腺癌的治療一直是困擾臨床多年的難題,目前越來越多的研究試圖尋找三陰性乳腺潛在的治療靶點[5,6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)m/z峰定位于6448的蛋白標(biāo)記物在侵襲性較高的三陰性乳腺癌中表達(dá)低于非三陰性乳腺癌,這也提示我們這一蛋白標(biāo)記物的降低與乳腺癌腫瘤惡性程度的升高可能相關(guān),初步建立了SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)結(jié)合SVM的乳腺癌血清尤其是三陰性乳腺癌血清蛋白篩選模型[7]。

    目前,關(guān)于載脂蛋白與腫瘤關(guān)系的研究還非常少,以往對于載脂蛋白的研究主要集中在其對脂蛋白代謝的調(diào)節(jié)上[8-10],近年來有一些研究報道了載脂蛋白C-I在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面的作用,除了在脂質(zhì)代謝方面的作用,一些激酶可以被載脂蛋白C-I激活或抑制,進而實現(xiàn)調(diào)節(jié)生理或病理過程的作用,與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Yasui等[11]通過基因表達(dá)分析(SAGE)發(fā)現(xiàn)與正常胃上皮細(xì)胞相比,載脂蛋白C-I在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)等。Christine等[12]通過對胰腺癌組織進行原位雜交發(fā)現(xiàn),載脂蛋白C-I在侵襲性胰腺癌組織中高表達(dá)。Yamamoto-Ishikawa等[13]對激素耐藥的前列腺癌進行研究,發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-I定位于這類前列腺癌的細(xì)胞質(zhì)中,在疾病進展過程中血清載脂蛋白C-I蛋白表達(dá)水平升高。這些結(jié)果都表明載脂蛋白C-I可能參與了多種類型的癌癥的發(fā)生及發(fā)展過程,目前參與發(fā)病的確切機制還不清楚,值得進一步探討。Goncalvesa等[14]一項對乳腺癌術(shù)后病人血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究,篩選并鑒定出差異蛋白質(zhì)為載脂蛋白AI和載脂蛋白CI,并且發(fā)現(xiàn)兩者在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組均呈低表達(dá)。這一結(jié)論和我們的研究結(jié)果非常類似,均提示載脂蛋白CI的低表達(dá)可能與乳腺癌較差的預(yù)后有關(guān)。同時再次印證了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究對于預(yù)測乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定積極的臨床意義。

    綜上所述,ApoC-I肽段在乳腺癌患者中明顯低于健康人群,術(shù)后隨著瘤荷的降低ApoC-I肽段隨之升高,而且在侵襲性較強、惡性程度較高的乳腺癌亞型中ApoC-I肽段的表達(dá)更低,是因為腫瘤的發(fā)生導(dǎo)致ApoC-I的表達(dá)量消耗性下降,還是因為ApoC-I的表達(dá)量下降而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,二者之間的作用機制及原理,均有待更深入研究。

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