紫外線照射對(duì)小鼠APOBEC3 mRNA表達(dá)水平的影響①

吳小霞 許天委 李國(guó)寅 程睿菁

(瓊臺(tái)師范學(xué)院數(shù)理系 海南海口 571127)

除AID(Activation-induced cytidine deaminase，活化誘導(dǎo)的脫氨酶，簡(jiǎn)稱AID)外，所有的哺乳動(dòng)物都有至少4個(gè)APOBEC(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like，載脂蛋白BmRNA編輯酶催化樣蛋白，簡(jiǎn)稱APOBEC)基 因 ，即APOBECs1、APOBEC2、APOBEC3和APOBEC4[1-2]。APOBECs是脊椎動(dòng)物一個(gè)可抑制胞嘧啶脫氨酶家族，主要在各種類型的細(xì)胞中進(jìn)行固有免疫應(yīng)答，在單鏈DNA中產(chǎn)生作用，將DNA或RNA的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化U，使得DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)G向A的超突變[3-5]。

AID和A2可能是祖先成員，A1和A3是經(jīng)進(jìn)化產(chǎn)生的，而A3s只在有胎盤的哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)，其基因拷貝數(shù)有物種特異性。例如，小鼠只有1個(gè)A3基因，豬有2個(gè)A3基因，綿羊和牛有3個(gè)A3基因，貓有4個(gè)A3基因，馬有6個(gè)A3基因，而靈長(zhǎng)類有7個(gè)A3基因[3]。

人類A3基因位于22號(hào)染色體，編碼APOBEC3A(簡(jiǎn)稱A3A)、 APOBEC3B(簡(jiǎn)稱A3B)、 APOBEC3C(簡(jiǎn)稱A3C)、APOBEC3D(簡(jiǎn)稱A3DE)、 APOBEC3F(簡(jiǎn)稱A3F)、 APOBEC3G(簡(jiǎn)稱A3G)及APOBEC3H(簡(jiǎn)稱A3H)等7個(gè)蛋白[4-6]， 其中A3A、A3C和A3H只有一個(gè)胞嘧啶脫氨酶域，而A3B、A3DE、A3F和A3G有2個(gè)脫氨酶域。A3蛋白在不同組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尤其是在HIV-1的靶細(xì)胞中，例如CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[7]。

在大量野生型小鼠組織中也檢測(cè)到A3mRNA，其中胸腺和淋巴結(jié)中A3mRNA表達(dá)水平最高，暗示淋巴組織的優(yōu)先功能[1]。小鼠A3位于15號(hào)染色體，由14個(gè)外顯子組成，是小鼠固有免疫系統(tǒng)的重要組成成員。依據(jù)波長(zhǎng)可將紫外線分為紫外線A(UVA，315～400nm)、 紫外線B(UVB， 280～315nm)和紫外線C(UVC，100～280nm)[8]。UVC是紫外線輻射中最具破壞性的類型，并可引起許多細(xì)胞的生理反應(yīng)，UVC一直用于滅菌和消毒，并且暴露于UVC中產(chǎn)生的傷害程度正在增加。紫外光與人體健康密切相關(guān)，陽(yáng)光下的紫外線會(huì)對(duì)皮膚、眼睛和免疫系統(tǒng)造成急性或慢性傷害，在全球范圍內(nèi)，大約有60 000人死于由紫外線照射引起的疾病，主要是惡性黑色素瘤[8]。

本研究通過對(duì)km小鼠實(shí)施3個(gè)月的UVC紫外線照射，利用熒光定量PCR研究小鼠A3mRNA表達(dá)水平的變化，為進(jìn)一步了解機(jī)體對(duì)紫外線等誘變劑的應(yīng)答機(jī)制提供參考，同時(shí)為深入了解癌癥發(fā)病機(jī)制等提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠

km小鼠雌、雄各5只，5-6周大，每只體重約25g。

1.1.2 試劑和儀器

RNA提取試劑盒(Thermo GeneJET RNA Purification Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR(ABI PowerUp SYBR Green Master Mix)購(gòu)自海南山清科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中使用紫外燈(20W)、離心機(jī)(eppendorf 5424R)、PCR儀(stratagene mx3005p)、酶標(biāo)儀(Biotek Synergy HTX)、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-4100)。

引物為上海生工生物工程股份有限公司合成，MM-ACTB(174 bp)(F： GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG； R： ATGCCACAGGATTCCATACC)； MM-A3(92 bp)(F： CATGGAGCTGAGCCAAGTGA； R： GATCCCTTTTGAATGCCGCC)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為4組，包括空白對(duì)照組(雄性小鼠2只、雌性小鼠2只)、實(shí)驗(yàn)照射組(雄性小鼠3只、雌性小鼠3只)。

1.2.2 紫外線照射

實(shí)驗(yàn)照射組小鼠每天用20W紫外燈(254 nm)照射20 min，連續(xù)照射3個(gè)月。

1.2.3 組織取樣

分別取各組小鼠的胸腺、淋巴結(jié)、肝臟、乳腺、骨髓、腎臟、膀胱、卵巢(雌性)、睪丸(雄性)并在-80℃凍存。

1.2.4 提取RNA

按照Thermo GeneJET RNA Purification Kit使用說明提取小鼠胸腺、淋巴結(jié)、肝臟、乳腺、骨髓、腎臟、膀胱、卵巢(雌性)及睪丸(雄性)組織中的RNA。首先，分別稱量30 mg冷凍組織，研缽搗碎，使用轉(zhuǎn)子-定子均質(zhì)器破壞和均勻化，加入600μL稀釋的蛋白酶K(10 μL的含蛋白酶K在590 μL的TE緩沖液中稀釋)；旋渦混合并在15～25℃孵育10 min；12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到不含RNase的微離心管中，加入450μL 100%乙醇溶液混合；轉(zhuǎn)移700μL的裂解物到插入收集管的純化柱(GeneJET RNA PurificationColumn)，12 000×g離心1 min，丟掉廢液，將純化柱重新放回收集管；向純化柱加入700μL洗滌Buffer1，12 000×g離心1 min，丟掉廢液，將純化柱重新放回收集管；向純化柱加入600μL洗滌Buffer2，12 000×g離心1 min，丟掉廢液，將純化柱重新放回收集管；向純化柱加入250μL洗滌Buffer2，12 000×g離心2 min；向純化柱的中間部位加入100μL無(wú)核酶的水，12000×g離心1 min；丟掉純化柱，于-70℃保存。

1.2.5 RNA檢測(cè)

先用TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零；然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1∶100)，讀取其在分光光度計(jì)260 nm和280 nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液的濃度和純度，經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外透射光下觀察并拍照。

1.2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄

按照Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.7 熒光定量PCR

參照ABI PowerUp SYBR Green Master Mix說明書進(jìn)行熒光定量PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，分光光度計(jì)測(cè)定的樣品RNAOD260/OD280均在1.84～2.13。電泳圖見圖1，前面的是18S帶，后面的是28S帶，18S帶的密度大約是28S帶的2倍，而且溴酚藍(lán)附近的5S帶很弱，證明提取的RNA質(zhì)量很好。

圖1 RN A瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 引物特異性檢測(cè)

將電泳后的瓊脂糖凝膠在紫外透射光下觀察并拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2號(hào)泳道和4號(hào)泳道分別呈ACTIN陽(yáng)性 和A3 92bp陽(yáng)性，見圖2。

圖2 引物特異性檢測(cè)電泳圖

2.3 熒光定量PCR結(jié)果

利用ACTIN作為內(nèi)參基因，對(duì)小鼠的A3mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果顯示，空白雄性小鼠胸腺組織中A3mRNA的表達(dá)水平明顯低于空白雌性小鼠；照射雄性小鼠胸腺組織中A3mRNA的表達(dá)水平有所提高(照射雄鼠1和3的A3mRNA表達(dá)水平明顯提高，照射雄鼠2的A3mRNA表達(dá)水平較低)(圖3-A)；而照射雌性小鼠胸腺組織A3mRNA的表達(dá)水平顯著提高。本研究認(rèn)為A3基因在小鼠胸腺組織中的表達(dá)穩(wěn)定而豐富，但是A3 mRNA在胸腺組織中的表達(dá)水平似乎與其性別有關(guān)。

A3mRNA在雌、雄空白小鼠淋巴結(jié)中的表達(dá)無(wú)明顯差異，照射雄鼠淋巴結(jié)中A3mRNA的表達(dá)有所提高，尤其是照射雄鼠3的A3mRNA表達(dá)水平明顯提高，而照射雌鼠淋巴結(jié)A3mRNA的表達(dá)也有所提高(圖3-B)。因此，本研究認(rèn)為紫外線照射使得小鼠淋巴結(jié)A3mRNA的表達(dá)水平有所提高。

A3mRNA在空白小鼠肝臟組織穩(wěn)定表達(dá)，雌雄差異表達(dá)不太明顯，而紫外線照射后小鼠肝臟的A3mRNA表達(dá)水平下降(圖3-C)，表明3個(gè)月的紫外線照射對(duì)小鼠肝臟的傷害較為嚴(yán)重。

小鼠乳腺組織A3mRNA定量分析結(jié)果顯示，雌性空白小鼠A3mRNA的表達(dá)水平明顯高于雄性小鼠，紫外線照射后的雄性和雌性小鼠的A3mRNA表達(dá)水平都有所提高(圖3-D)。因此，本研究認(rèn)為3個(gè)月的紫外線照射使得小鼠乳腺組織A3mRNA的表達(dá)水平有所提高。

另外，A3mRNA在雄性空白小鼠骨髓的表達(dá)可能要高于雌性小鼠，紫外線照射3個(gè)月后，雌雄小鼠骨髓中A3mRNA的表達(dá)水平與空白小鼠相比明顯下降(圖3-E)。所以本研究認(rèn)為3個(gè)月的紫外線照射使得小鼠骨髓A3mRNA的表達(dá)水平下降。

小鼠腎臟組織A3mRNA定量分析結(jié)果顯示，A3mRNA在空白小鼠腎臟組織的表達(dá)較為穩(wěn)定，而紫外線照射后小鼠的A3mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)出一定的個(gè)體差異性(圖3-F)。因此，本研究認(rèn)為3個(gè)月的紫外線照射對(duì)小鼠腎臟組織A3mRNA表達(dá)水平的影響具有個(gè)體差異。

小鼠膀胱A3mRNA定量分析顯示，空白雄性小鼠膀胱組織中A3mRNA的表達(dá)水平明顯低于空白雌性小鼠，照射雌性小鼠膀胱組織A3mRNA(圖3-G)的表達(dá)水平有所提高。因此，本研究認(rèn)為3個(gè)月的紫外線照射使得 A3mRNA的表達(dá)水平提高，雌性小鼠A3mRNA的表達(dá)水平可能高于雄性小鼠。

小鼠性腺A3mRNA定量分析結(jié)果顯示，空白雌性小鼠卵巢組織中A3mRNA的表達(dá)量約為空白雄性小鼠睪丸組織的3倍，照射雄性小鼠睪丸組織中A3mRNA的表達(dá)水平有一定提高，而照射雌性小鼠卵巢組織A3mRNA的表達(dá)水平較空白雌鼠也有有所提高(圖3-H)。因此，本研究認(rèn)為3個(gè)月的紫外線照射使得小鼠性腺組織 A3 mRNA的表達(dá)水平提高，且雌性小鼠A3mRNA的表達(dá)水平可能高于雄性小鼠。

4 討論

圖3 小鼠不同組織A 3m RN A的定量分析

續(xù)圖3 小鼠不同組織A 3m RN A的定量分析

很多研究已表明哺乳動(dòng)物A3是其固有免疫系統(tǒng)的一部分。在無(wú)A3的動(dòng)物中，有效的F-MuLV感染細(xì)胞總數(shù)在脾臟和骨髓中增加10～100倍，骨髓來(lái)源的細(xì)胞是有效的M-MuLV感染所需的[9]。小鼠雖然只有一個(gè)A3基因，但小鼠A3可通過誘導(dǎo)病毒DNA中高水平的G突變?yōu)锳，具有與人類A3G一樣強(qiáng)大的ΔVifHIV-1限制能力。小鼠A3也有2個(gè)脫氨酶域，只是人類A3G缺乏脫氨酶活性的N端域是進(jìn)入病毒所必須的，而其C端域卻具有脫氨酶活性。值得一提的是，小鼠A3的功能排列與人類A3G相反，即人類C端結(jié)構(gòu)域是進(jìn)入病毒所必須的，而N端結(jié)構(gòu)域具有胞苷脫氨酶活性。

紫外線照射是一種機(jī)體突變誘變劑，可引起急性和慢性皮膚問題，如曬傷、色素沉著、免疫抑制、即將到來(lái)的刺激過敏、光老化和各種動(dòng)物的癌癥[9]等。與UVB一樣，UVC可引起組織反應(yīng)和DNA損傷，但其作用更明顯[9]。小鼠A3作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，在胸腺、乳腺、肝臟、性腺等組織穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)生物抵御外來(lái)病毒等具有重要作用。

本研究證實(shí)小鼠胸腺組織、淋巴結(jié)、膀胱、性腺(雄性睪丸、雌性卵巢)、肝臟、乳腺組織、骨髓以及腎臟組織中有A3mRNA的表達(dá)。另外，空白小鼠中胸腺、乳腺、骨髓、膀胱以及性腺A3mRNA的表達(dá)有明顯的性別差異，雄性小鼠胸腺、乳腺、膀胱及性腺中A3mRNA的表達(dá)明顯低于雌性小鼠，而雄性小鼠骨髓中的A3mRNA的表達(dá)明顯高于雌性小鼠。而在肝臟、淋巴結(jié)和腎臟組中的A3mRNA表達(dá)性別差異不太明顯。紫外線照射后小鼠胸腺、淋巴結(jié)、膀胱、性腺以及乳腺組織中A3mRNA的表達(dá)顯著增加，而骨髓和肝臟中的A3mRNA的表達(dá)顯著降低；小鼠腎臟中A3mRNA的表達(dá)差異較大，照射雄鼠A3mRNA的表達(dá)可能是增加的，而雌鼠可能是降低的。

小鼠A3mRNA在胸腺組織和淋巴結(jié)穩(wěn)定表達(dá)并有顯著的性別差異，暗示作為中樞免疫器官的胸腺和外周免疫器官的淋巴結(jié)在小鼠應(yīng)答紫外線傷害的反應(yīng)中起著重要的作用，且雌性小鼠的免疫能力高于雄性小鼠。而在同為中樞免疫器官的小鼠骨髓中，A3mRNA的表達(dá)水平是顯著下降的，且雄性小鼠的下降水平極為明顯，這表明紫外線照射后對(duì)雄性小鼠的抵抗力影響更為明顯。紫外線照射使得雌性小鼠乳腺組織中A3的表達(dá)量明顯提高，表明乳腺組織在小鼠免疫應(yīng)答中起一定作用，也表明雌性小鼠的免疫功能似乎強(qiáng)于雄性小鼠。小鼠膀胱與性腺組織中A3mRNA的表達(dá)暗示雌性小鼠A3mRNA的表達(dá)穩(wěn)步提高，而雄性小鼠A3的表達(dá)顯示出明顯的個(gè)體差異性。紫外線照射總體上降低小鼠肝臟組織中A3mRNA的表達(dá)水平，表明肝臟在紫外線照射中受到的傷害可能更為嚴(yán)重。紫外線照射是一種機(jī)體突變誘變劑，考慮到肝臟和骨髓在生物體中的重要作用，本研究認(rèn)為小鼠肝臟和骨髓組織中A3mRNA的表達(dá)水平下降可能是紫外線照射使得機(jī)體肝臟和骨髓受到重創(chuàng)，從而誘發(fā)機(jī)體肝臟和骨髓發(fā)生相關(guān)的腫瘤。

總之，小鼠A3作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，在胸腺、乳腺、肝臟、性腺等組織穩(wěn)定表達(dá)，在應(yīng)答機(jī)體受到紫外線傷害時(shí)，其mRNAs表達(dá)水平的變化表明A3確實(shí)發(fā)揮了重要作用。但是本研究中所選的樣本較少，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性可能會(huì)產(chǎn)生影響，因此，若要進(jìn)一步深入研究A3在紫外線照射中所起的作用，應(yīng)選擇更多的樣本，才能為闡明機(jī)體的固有免疫應(yīng)答機(jī)制以及治療相關(guān)疾病提供較好的參考價(jià)值。

5 結(jié)語(yǔ)

固有免疫系統(tǒng)是開啟抗病毒應(yīng)答的第一道防線，A3作為APOBEC脫氨酶家族的成員之一，也在機(jī)體固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用[1-5,10]。人類A3有7個(gè)成員，小鼠只有1個(gè)A3。A3基因通過利用突變逆轉(zhuǎn)座子、外源病毒和內(nèi)源病毒廣泛參與固有免疫應(yīng)答。紫外線是1種可導(dǎo)致基因突變的誘變劑，對(duì)生物體造成程度不一的傷害。本研究利用20 W紫外燈對(duì)普通野生型小鼠每天照射20 min，連續(xù)照射3個(gè)月，然后進(jìn)行A3mRNA的相對(duì)定量分析。結(jié)果顯示,在小鼠胸腺、淋巴結(jié)、肝臟、乳腺、骨髓、腎臟、膀胱以及性腺組織中均檢測(cè)到了A3 mRNA；小鼠的胸腺、乳腺、骨髓、膀胱以及性腺中A3mRNA的表達(dá)具有較為明顯的性別差異，其中雌鼠胸腺、淋巴結(jié)、乳腺、膀胱及性腺組織A3mRNA的表達(dá)高于雄鼠，而雄鼠骨髓中的A3mRNA表達(dá)高于雌鼠；照射小鼠胸腺、淋巴結(jié)、膀胱、性腺以及乳腺組織中A3mRNA的表達(dá)顯著提高，而骨髓和肝臟中A3mRNA的表達(dá)明顯下降。這些數(shù)據(jù)顯示A3在小鼠免疫應(yīng)答中起重要作用。