仿生消化法測定豬飼料原料還原糖釋放量的重復(fù)性和可加性研究

廖 睿 趙 峰 張 虎 王鈺明 張宏福

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193)

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仿生消化法測定豬飼料原料還原糖釋放量的重復(fù)性和可加性研究

廖 睿 趙 峰*張 虎 王鈺明 張宏福

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193)

本試驗旨在建立單胃動物仿生消化系統(tǒng)模擬豬飼料原料消化后還原糖釋放量的測定方法，為飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價的評估提供參考。還原糖釋放量與上樣量的線性關(guān)系研究以玉米-豆粕混合物(75%玉米+25%豆粕)為研究對象，上樣量設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g 5個處理，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管；方法的重復(fù)性檢驗以玉米-豆粕混合物、大麥、花生粕和米糠為研究對象，每個樣品設(shè)3個批次，每個批次4個重復(fù)；方法的可加性檢驗設(shè)19個處理，其中處理1～7分別為玉米、大麥、高粱、大豆粕、花生粕、棉籽粕和米糠，處理8～19為2種或2種以上飼料原料按不同比例組合制備的12種混合飼料，每個處理4個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管，在仿生消化系統(tǒng)中模擬豬消化后測定各處理的還原糖釋放量。結(jié)果表明：上樣量在0.2～0.8 g時，還原糖總釋放量與上樣量呈顯著的線性關(guān)系(R2=0.999 2)，還原糖相對釋放量在559.56～582.70 mg/g DM變化，變異系數(shù)為1.66%，而上樣量為1.0 g時，還原糖相對釋放量比上樣量為0.2～0.8 g時的平均值下降5.37%；3個批次的大麥、花生粕、米糠和玉米-豆粕混合物的還原糖釋放量的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)和總變異系數(shù)均不大于1.68%，批間最大相對偏差分別為0.68%、1.50%、1.39%和0.29%；12種混合飼料還原糖釋放量的實測值顯著高于計算值(P<0.05)，而還原糖釋放量的計算值與實測值的線性回歸模型與y=x相重合(截距P=0.480 5；斜率P=0.514 1)。由此得出，當(dāng)上樣量在0.2～0.8 g時，上樣量與還原糖釋放量呈顯著線性關(guān)系；仿生消化法測定豬飼料原料還原糖釋放量的重復(fù)性和可加性滿足定量分析的基本要求。

仿生消化系統(tǒng)；還原糖；重復(fù)性；可加性

豬飼糧中碳水化合物的含量在60%以上，其中淀粉的含量在40%左右[1]，非淀粉多糖的含量在9.32%～59.97%[2]，這些碳水化合物可在酶的催化下水解成含有醛基的還原糖，是動物潛在可利用的養(yǎng)分。因此，建立以仿生消化方法測定飼料原料的還原糖釋放量對飼料營養(yǎng)價值的評定及飼用酶制劑效應(yīng)的評估有重要意義。目前，在飼料原料經(jīng)酶水解后還原糖釋放量的測定方法上，基于非淀粉多糖酶活性的測定方法[3-4]，師昆景等[5]建立了飼料原料在4種非淀粉多糖酶催化后還原糖釋放量的測定方法。Pedersen等[6]以仔豬胃和小腸內(nèi)獲得的消化液及干食糜為材料，在24孔板內(nèi)模擬體內(nèi)的消化過程，建立了仔豬食糜在木聚糖酶催化后木糖釋放量的測定方法。薛梅等[7]在三角瓶中以胃蛋白酶及胰液素2個階段消化為基礎(chǔ)，簡述了飼料在模擬家禽體內(nèi)消化后還原糖釋放量的測定方法。然而，以上試驗并未研究測定方法的重復(fù)性與可加性是否滿足定量分析的基本要求。從測定的過程看，這些方法仍會出現(xiàn)飼料樣品粘貼于消化管壁而難以與消化液充分接觸，微生物發(fā)酵引起反應(yīng)液pH急劇下降等一系列問題，從而影響測試結(jié)果的精確性。針對上述問題，Zhao等[8]在研制了用于測定飼料酶水解物能值的單胃動物仿生消化系統(tǒng)(SDS-2)的基礎(chǔ)上，進一步開發(fā)了以仿生消化法測定飼料原料還原糖釋放量的模塊。本研究基于該模塊從上樣量與還原糖釋放量的線性關(guān)系、測定結(jié)果的重復(fù)性和可加性3個方面展開研究，旨在為建立飼料在消化酶水解后還原糖釋放量的測定方法方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料原料

選用玉米、大麥、高粱、米糠、豆粕、棉籽粕和花生粕為代表性飼料原料。采用四分法取樣后粉碎過40目篩。充分混合均勻后，貯存于樣品瓶中-20 ℃保存?zhèn)溆谩ｏ暳显霞捌錉I養(yǎng)成分列于表1。其中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、粗脂肪、粗纖維含量及總能分別按照GB/T 6435—2006[9]、GB/T 6432—1994[10]、GB/T 6438—2007[11]、GB/T 6433—2006[12]、GB/T 6434—2006[13]、ISO 9831—1998[14]的方法進行測定，無氮浸出物含量為計算值，計算公式為：

無氮浸出物含量=100-(粗蛋白質(zhì)含量+粗纖維含量+粗脂肪含量+粗灰分含量)。

表1 飼料原料及其營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計

本研究由3個試驗組成。其中試驗1研究上樣量與還原糖釋放量的線性關(guān)系。以玉米∶豆粕按75∶25比例混合配制成玉米-豆粕混合物，上樣量設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g 5個處理，每個處理設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。試驗2研究不同測定批次間飼料經(jīng)消化酶水解后還原糖釋放量的重復(fù)性。以玉米-豆粕混合物、大麥、花生粕和米糠為研究對象，每個樣品設(shè)3個測定批次，每個批次設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。試驗3研究飼料原料間在仿生消化后還原糖釋放量的可加性，共19個處理(表2)，其中處理1～7為7種單一飼料原料，處理8～19為2種或2種以上飼料原料按不同比例組合制備的12種混合飼料，每個處理設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。在仿生消化系統(tǒng)中以豬模擬消化液及流程測定各處理還原糖的釋放量。

1.3 仿生消化法測定飼料的還原糖釋放量

1.3.1 豬模擬消化液及反應(yīng)溶液的制備

胃緩沖液(pH 3.0)：稱取2.59 g氯化鈉和0.25 g氯化鉀，倒入500 mL燒杯中，加350 mL去離子水溶解，并用2 mol/L的鹽酸(HCl)在39 ℃下調(diào)節(jié)溶液的pH至3.0。冷卻后將上述溶液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，去離子水定容。

小腸緩沖液：稱取0.52 g無水磷酸氫二鈉、2.57 g無水磷酸二氫鈉和青霉素12萬U，倒入100 mL燒杯中，加40 mL去離子水溶解，并用1 mol/L的磷酸或1 mol/L的氫氧化鈉在39 ℃下調(diào)節(jié)溶液的pH至6.30。冷卻后將上述溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，去離子水定容。

表2 試驗2各處理樣品組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

模擬胃液(胃蛋白酶活性737.5 U/mL)：稱取147.5 kU的胃蛋白酶(Sigma，P7000)，溶解于200 mL pH 3.0的胃緩沖液中，緩慢攪拌直至溶解，臨用前配制。

模擬小腸液：稱(量)取淀粉酶(Sigma，A3306)41.41 kU、胰蛋白酶(Amersco，0785)12.82 kU、糜蛋白酶(Amersco，0164)1.62 kU，溶解于17 mL去離子水中，并緩慢攪拌直至溶解15 min以上，臨用前配制。

1.3.2 基于仿生消化系統(tǒng)的飼料還原糖釋放量測定過程

稱取一定質(zhì)量的飼料樣品(1 g以內(nèi)，精確到0.000 2 g)置于玻璃模擬消化管中，同步測定樣品的干物質(zhì)含量；往消化管中加入10 mL模擬胃液，模擬消化器另一端安裝好電動攪拌器；將模擬消化器置于預(yù)熱好的單胃動物仿生消化系統(tǒng)中，按照模擬消化器下端進水、上端出水的原則，接好管路。每組5根模擬消化器間串聯(lián)連接。消化液加液管和緩沖液加液管與系統(tǒng)以快速接頭相連，攪拌電機的插頭與電源相連接；在單胃動物仿生消化系統(tǒng)控制軟件中，胃階段模擬消化的參數(shù)為：溫度39 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速180 r/min，消化時間4 h；在胃模擬消化結(jié)束時，將6 mL小腸緩沖液通過3號蠕動泵自動注入消化管中，然后通過4號蠕動泵將1.6 mL模擬小腸液自動泵入模擬消化管中；在單胃動物仿生消化系統(tǒng)控制軟件中，小腸階段模擬消化的參數(shù)為：溫度39 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速180 r/min，消化時間為16 h；小腸模擬消化結(jié)束后，將玻璃消化管內(nèi)的消化液無損失地轉(zhuǎn)移到合適體積的干凈容量瓶中，然后用去離子水定容，封口膜密封，搖勻備用(酶空白組不需要轉(zhuǎn)移到容量瓶中，直接濾膜過濾)。從容量瓶中取30 mL消化液，用一次性注射器吸取，通過0.22 μm濾膜過濾，濾液進行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋備用。取2 mL稀釋后的消化液加入到試管中，然后加入2 mL去離子水，振蕩混勻，加5 mL二硝基水楊酸(DNS)溶液并沸水浴5 min，冷卻至室溫后定容至25 mL，混勻，540 nm處測吸光度(OD)值。參照GB/T 23881—2009[4]的方法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及配制DNS溶液。

1.4 還原糖釋放量的計算

按GB/T 6435—2006[9]的方法測定樣品水分并計算其干物質(zhì)含量，還原糖釋放量計算公式如下：

還原糖釋放量(mg/g DM)=[(a×OD1+b)×
D×V-(a×OD2+b)×17.6]/(w×DM)

式中：a為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸常數(shù)；OD1為每個重復(fù)測定管的OD值；OD2為消化酶空白管的OD值；D為樣品稀釋倍數(shù)；V為定容體積；w為每個重復(fù)測定管飼料樣品質(zhì)量；DM為飼料樣品的干物質(zhì)含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

以SAS 9.0的MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進行分析，批次變異系數(shù)、批間變異系數(shù)及總變異系數(shù)根據(jù)李輝等[15]的方法進行計算。最大絕對偏差=Max{[(最大值-平均值)+(平均值-最小值)]/2}，最大相對偏差=最大絕對偏差/平均值×100。采用GLM模塊對數(shù)據(jù)進行方差分析；采用REG模型進行還原糖釋放量與上樣量線性模型的分析；通過TTEST模塊的Paired選項對飼料還原糖釋放量的實測值與計算值間的差異進行配對t檢驗。以REG模塊通過TEST選項分析飼糧還原糖釋放量的計算值與實測值的回歸斜率與截距分別與1和0的顯著性差異，判斷實測值與計算值是否相等，從而檢驗方法是否具有可加性。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿生消化法測定還原糖釋放量與上樣量的線性關(guān)系

還原糖釋放量與上樣量的關(guān)系如圖1所示，隨著上樣量在0.2～1.0 g間遞增，還原糖總釋放量呈線性增加(R2=0.997 9，P<0.01)；特別是上樣量在0.2～0.8 g間遞增時，上樣量與還原糖總釋放量的線性關(guān)系進一步增強(R2=0.999 2，P<0.01)。從上樣量對還原糖相對釋放量(每克樣品干物質(zhì)還原糖的釋放量)的影響看，上樣量為0.2～0.8 g時，計算出的還原糖相對釋放量在559.56～582.70 mg/g DM變化，變異系數(shù)為1.66%；而當(dāng)上樣量為1.0 g時，計算出的還原糖相對釋放量為540.20 mg/g DM，比上樣量為0.2～0.8 g時所計算的還原糖相對釋放量平均值低5.37%。

數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖1 上樣量對還原糖釋放量的影響

Fig.1 Effect of sample volume on the released amount of reducing sugar

2.2 仿生消化法測定飼料還原糖釋放量的重復(fù)性

由表3可知，同一批次的4個重復(fù)內(nèi)，大麥、花生粕、米糠和玉米-豆粕混合物的還原糖釋放量的最大相對偏差分別為1.40%、2.19%、0.88%和0.39%，批次內(nèi)變異系數(shù)分別為0.93%、1.29%、0.61%和0.34%；不同測定批次間大麥、花生粕、米糠和玉米-豆粕混合物的還原糖釋放量的最大相對偏差分別為0.68%、1.50%、1.39%和0.29%，批次間變異系數(shù)分別為0.64%、1.27%、1.36%和0.25%。3個批次的4個重復(fù)測定中，大麥、花生粕、米糠和玉米-豆粕混合物的總變異系數(shù)分別為1.02%、1.68%、1.46%和0.38%。從不同批次的還原糖釋放量平均值的多重比較統(tǒng)計結(jié)果可以看出，花生粕和米糠的還原糖釋放量在測定批次間存在顯著性差異(P<0.05)。

表3 仿生消化法測定飼料還原糖釋放量的重復(fù)性

2.3 仿生消化法測定飼料原料間還原糖釋放量的可加性

由表4可知，仿生消化后獲得的由玉米、大麥、高粱、大豆粕、花生粕、棉籽粕和米糠按不同比例混合配制而成的12種混合飼料的還原糖釋放量的實測值顯著高于計算值(P<0.05)，而從還原糖釋放量的計算值與實測值的線性回歸分析可以得出，回歸模型的決定系數(shù)為0.999 6(P<0.05)，截距與0比較無顯著性差異(截距=-1.99，P=0.480 5)，斜率與1比較無顯著性差異(斜率=0.99，P=0.514 1)。這說明12種混合飼料的還原糖釋放量的實測值與計算值的一元線性回歸模型與y=x這條直線相重合。

3 討 論

3.1 上樣量對還原糖釋放量的影響

飼糧在畜禽體內(nèi)的消化分為物理消化、化學(xué)消化及微生物消化，其中以消化酶參與的化學(xué)消化起主導(dǎo)作用[16]。除幼齡動物外，健康畜禽體內(nèi)消化酶的分泌量超過其對飼糧相應(yīng)底物完全水解的需要量[17]。在基于透析分離水解產(chǎn)物的仿生消化中，模擬消化液中主要消化酶的活性與體內(nèi)消化液接近[8]，消化液的體積(mL)與樣品上樣量(g)的比例在10∶1以上，該比值接近或高于體內(nèi)腸道食糜的相應(yīng)比值[18]。因此，相對于樣品的上樣量，酶的活性是過量的。本研究中，為了準(zhǔn)確測定水解液中產(chǎn)物的生成量，仿生消化過程與外界無物質(zhì)交換。因此，在模擬消化液體積不變的情況下，隨著上樣量的增加可能存在水解產(chǎn)物對酶促反應(yīng)的抑制，當(dāng)酶活性過量且產(chǎn)物抑制效應(yīng)不明顯時，酶促反應(yīng)速度呈一級反應(yīng)，即產(chǎn)物的生成量與底物濃度呈線性關(guān)系[19]。而當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大并出現(xiàn)明顯的產(chǎn)物抑制效應(yīng)時，則會出現(xiàn)產(chǎn)物的生成量隨底物濃度增加而偏離上述線性關(guān)系。本試驗中，隨著上樣量在0.2～0.8 g間梯度增加，還原糖釋放量呈線性增加。然而，上樣量為1.0 g的處理對上樣量與還原糖釋放量的線性關(guān)系有明顯影響。當(dāng)上樣量在0.2～0.8 g間梯度變化時，所計算的每克樣品的還原糖釋放量相對穩(wěn)定；而上樣量在1.0 g時，所計算的每克樣品的還原糖相對釋放量出現(xiàn)明顯下降。上述結(jié)果表明，本仿生消化方法中，上樣量在0.8 g以上時水解產(chǎn)物對酶促反應(yīng)的抑制較為明顯，從而使還原糖的釋放量偏離上樣量與還原糖釋放量的穩(wěn)定線性關(guān)系。因此，本方法中上樣量應(yīng)控制在0.2～0.8 g之間。

表4 還原糖釋放量的實測值與計算值

1)還原糖釋放量實測值與計算值的回歸分析。Regression analysis of determined values and calculated values of the released amount of reducing sugar.

2)無效假設(shè)：截距=0；備擇假設(shè)：截距≠0。H0: intercept=0; Hα: intercept≠0.

3)無效假設(shè)：斜率=1；備擇假設(shè)：斜率≠1。H0: slope=1; Hα: slope≠1.

4)回歸模型的顯著性。The significance of regression model.

3.2 仿生消化法測定豬飼料原料還原糖釋放量的重復(fù)性和可加性

重復(fù)性與可加性是檢驗定量分析方法是否成立的關(guān)鍵。統(tǒng)計學(xué)定義重復(fù)性是在重復(fù)測試條件下，得到的獨立測定結(jié)果間的一致程度[20]。一般通過批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)及總變異系數(shù)來表示方法重復(fù)性的優(yōu)劣[15]。本試驗對玉米-豆粕飼糧、大麥、花生粕和米糠各進行3個批次測定仿生消化后的還原糖釋放量，其批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)及總變異系數(shù)均在1.68%以內(nèi)，該變異程度與仿生消化法測定飼料的干物質(zhì)消化率及酶水解物能值的變異系數(shù)(在1.40%以內(nèi))類似[15]，比實驗室間測定飼料干物質(zhì)含量及總能的變異系數(shù)(分別為1.27%和1.29%)稍高[21]，但是比基于三角瓶的模擬消化法測得的飼料干物質(zhì)消化率變異系數(shù)(6.89%)低[22]。這表明仿生消化法測定飼料原料還原糖釋放量的變異程度可以達到飼料概略養(yǎng)分測定類似的重復(fù)性。雖然花生粕和米糠不同測定批次間的還原糖釋放量存在著差異顯著，但還原糖釋放量的批間最大絕對偏差分別為1.15和4.75 mg/g DM，相對偏差分別為1.50%和1.39%，它比飼料粗蛋白質(zhì)測定允許的相對偏差(3%以內(nèi))低[10]。因此，本試驗所用仿生消化法測定飼料還原糖釋放量的重復(fù)性是滿意的。

方法的可加性是指樣品間按不同比例組合后的測定值與理論值相等[8]。一般通過對多個待測樣品按不同比例組合形成一系列新樣品后，將新樣品所檢測的實測值與根據(jù)新樣品中單一樣品的比例及其測定值計算得到的計算值進行回歸分析，通過比較得到的回歸直線與y=x的顯著性檢驗來判斷[23]。生物學(xué)法測定雞飼料原料的代謝能值具有滿意的可加性[21]；仿生消化法測定飼料的酶水解物能值也具有較好可加性[24]。本研究中，由7種飼料原料配制的12種混合飼料，雖然配對t檢驗表明還原糖釋放量的實測值略高于計算值，但還原糖釋放量的實測值對計算值的回歸模型與y=x無顯著性差異。這表明仿生消化法測定豬飼料原料的還原糖釋放量具有滿意的可加性。

4 結(jié) 論

① 仿生消化法測定還原糖釋放量時，上樣量在0.2～0.8 g之間，上樣量與還原糖釋放量呈顯著線性關(guān)系。

② 仿生消化法測定豬飼料原料還原糖釋放量的重復(fù)性和可加性可滿足定量分析的基本要求。

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*Corresponding author， associate professor, E-mail: zsummit@hotmail.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

A Study on the Repeatability and Additivity of the Released Amount of Reducing Sugar of Feed Ingredients Determined with Simulated Digestion Method for Pigs

LIAO Rui ZHAO Feng*ZHANG Hu WANG Yuming ZHANG Hongfu

(StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Beijing100193,China)

This study was conducted to establish the method for determining the released amount of reducing sugar of feed ingredients digested with simulated digestion system to mimic the digestion of pigs, which provided a reference for the evaluation of feed nutrient bioavailability. A corn-soybean meal mixture (75% corn+25% soybean meal) was formulated to test the linear relationship between the released amount of reducing sugar and sample volume. Five treatments of sample volume were consisted of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 g. Each treatment contained 4 replicates with 1 digestion tube per replicate. Corn-soybean meal mixture, barley, peanut meal and rice bran were used to test the repeatability of the method. Each sample was determined for 3 batches with 4 replicates in each. There were 19 treatments to test the additivity of the method. Treatments 1 to 7 were corn, barley, sorghum, soybean meal, peanut meal, cottonseed meal and rice bran, respectively. Treatments 8 to 19 were 12 mixed feeds formulated with 2 or more than 2 kinds of feed ingredients at different proportions. Each treatment contained 4 replicates with 1 digestion tube per replicate. The released amount of reducing sugar of each treatment was determined after the feed was digested with simulated digestion system to mimic the digestion of pigs. The results showed as follows: when the sample volume ranged from 0.2 to 0.8 g, a significant linear relationship (R2=0.999 2) was observed between the total released amount of reducing sugar and sample volume, and the relative released amount of reducing sugar ranged from 559.56 to 582.70 mg/g DM with a coefficient of variation (CV) of 1.66%. However, the released amount of reducing sugar of 1.0 g sample was 5.37% lower than the mean of 0.2 to 0.8 g sample. The CV of intra-batch, inter-batch and total for the released amount of reducing sugar were all less than 1.68%, and the inter-batch maximum relative difference among repeated determinations were 0.68%, 1.50%, 1.39% and 0.29% for barley, peanut meal, rice bran and corn-soybean mixture, respectively. The determined values were greater than the calculated values of the released amount of reducing sugar in 12 mixed feeds (P<0.05). However, the linear regression model of calculated values and determined values of the released amount of reducing sugar was consistent to the line ofy=x(P=0.480 5 for intercept;P=0.514 1 for slope). It is concluded that a significant linear relationship is found between sample volume and the released amount of reducing sugar when the sample volume ranges from 0.2 to 0.8 g; the repeatability and additivity of the released amount of reducing sugar of feed ingredients determined with simulated digestion method for pigs can meet the basic requirements of quantitative analysis.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(1)：168-176]

simulated digestion system; reducing sugar; repeatability; additivity

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.01.019

2016-07-05

國家自然科學(xué)基金項目(31172215)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)

廖 睿(1990—)，男，湖北鄂州人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail： onemoremore@foxmail.com

*通信作者：趙 峰，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: zsummit@hotmail.com

S816

A

1006-267X(2017)01-0168-09