高產(chǎn)和高生物活性的鐵皮石斛液體培養(yǎng)體系研究

張杰 許風(fēng)國(guó)

摘要：通過(guò)對(duì)野生鐵皮石斛的定向誘導(dǎo)和逐步馴化，篩選適合液體懸浮生長(zhǎng)的鐵皮石斛原球莖，并對(duì)其ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）和Rbcl進(jìn)行分子鑒定。在此基礎(chǔ)上，建立了適合鐵皮石斛原球莖快速生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)體系，對(duì)蛋白、多糖、醇浸出物、金屬含量等成分進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以1/2MS+2.0 mg/L KT（激動(dòng)素）+0.5 mg/L NAA（萘乙酸）+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L馬鈴薯提取物為鐵皮石斛原球莖液體培養(yǎng)基，經(jīng)5周液體培養(yǎng)，采收原球莖（318.3±22.5） g/L（鮮質(zhì)量），平均生長(zhǎng)率為（9.7±0.59） g/（L·d）（鮮質(zhì)量），單個(gè)最大鮮質(zhì)量為23.7 g，多糖含量為（19.09±1.05）%，醇浸出物含量為（37.82±3.50）%，蛋白質(zhì)含量為42.51%，其中精氨酸含量高達(dá)19.23 mg/g，鉛、鎘、砷、汞、銅等金屬含量遠(yuǎn)低于最高限定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，采用該液體培養(yǎng)體系，可培育生產(chǎn)出高產(chǎn)和高生物活性的鐵皮石斛。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;原球莖;液體培養(yǎng);ITS; Rbcl

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）是一種珍稀中草藥，具有生津養(yǎng)胃、抗衰老、抗疲勞、降血糖、保肝護(hù)肝、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等作用[1-4]。在自然環(huán)境條件下，野生鐵皮石斛對(duì)生存環(huán)境要求苛刻，種子萌發(fā)需要共生菌等作用[5]，加上毫無(wú)節(jié)制過(guò)度采集，野生鐵皮石斛已被列為瀕危物種[6]。目前廣泛采用傳統(tǒng)方式種植鐵皮石斛中草藥，但這種種植培育方式不僅需占用大量土地，培育周期長(zhǎng)達(dá)3年，農(nóng)藥殘留和重金屬污染普遍嚴(yán)重，不同種石斛混合種植時(shí)，易造成異花傳粉和雜交變種，而且種植使用大量無(wú)機(jī)化肥，易造成環(huán)境污染和品質(zhì)下降等問(wèn)題。為解決鐵皮石斛這種傳統(tǒng)珍稀中草藥種植所面臨的問(wèn)題，培育品質(zhì)純正、無(wú)污染、高生物產(chǎn)量和高生物活性的鐵皮石斛，本研究利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，建立了一種新型液體培養(yǎng)體系，培育生產(chǎn)高質(zhì)量和高生物活性鐵皮石斛珍稀中草藥，可直接轉(zhuǎn)化到鐵皮石斛中試進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化培育生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 鐵皮石斛的定向誘導(dǎo)和液體培養(yǎng)體系

1.1.1 鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo) 試驗(yàn)于2015年在江蘇省蘇州市進(jìn)行。以浙江雁蕩山野生鐵皮石斛莖段為外植體，消毒處理，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的固體瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度為 25 ℃，采用全光譜LED（發(fā)光二極管）燈，光—暗周期12 h—12 h，光照度1 800 lx。

1.1.2 鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)和液體懸浮馴化 以鐵皮石斛愈傷組織細(xì)胞為材料，在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+2%蔗糖的固體瓊脂培養(yǎng)基上定向誘導(dǎo)原球莖的產(chǎn)生。在1/2MS+2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭的固體瓊脂培養(yǎng)基上，可實(shí)現(xiàn)原球莖的快速生長(zhǎng)增殖。將鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)接到1/2MS+2%蔗糖液體培養(yǎng)基中，逐步懸浮馴化，篩選適合液體懸浮生長(zhǎng)的鐵皮石斛原球莖新品系。培養(yǎng)環(huán)境條件均為25 ℃，采用全光譜LED燈，光—暗周期12 h—12 h，光照度1 800 lx。

1.1.3 鐵皮石斛液體培養(yǎng)體系 將適合液體懸浮生長(zhǎng)的鐵皮石斛原球莖新品系培育在1/2MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L馬鈴薯提取物的液體培養(yǎng)基中，將盛有液體培養(yǎng)基的三角瓶滅菌，于100 r/min懸浮液體培養(yǎng)，室溫25 ℃，光質(zhì)5 ∶ 1 LED紅藍(lán)光，光照度 2 500 lx，光—暗周期12 h—12h，液體培養(yǎng)5周。

1.2 鐵皮石斛分子鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用NCBI BLAST在線軟件對(duì)鐵皮石斛ITS和rbcL序列進(jìn)行比對(duì)分析，并從NCBI下載相關(guān)ITS和rbcL序列用于構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。用MEGA 7.0構(gòu)建鄰接系統(tǒng)樹(shù)，采用Clusta lW序列比對(duì)，系統(tǒng)樹(shù)自檢1 000次。

1.3 鐵皮石斛營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)和分析

1.3.1 多糖含量測(cè)定 鐵皮石斛原球莖干品和鐵皮楓斗粉碎過(guò)100目篩，100 ℃熱水回流，浸提2 h，離心過(guò)濾，取上清。上清液直接采用二硝基水楊酸（DNS）法[9]測(cè)定總糖（C總糖）、還原糖（C還原糖）和多糖含量（C多糖）。

C多糖=C總糖-C還原糖。

（1）

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，制作測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=1.981x-0.092 5，r2=0.992。

1.3.2 醇浸出物含量測(cè)定 根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》醇溶性浸出物測(cè)定方法[10]，采用熱浸法測(cè)定鐵皮石斛原球莖干品和鐵皮楓斗的醇浸出物含量。

1.3.3 氨基酸營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 根據(jù)國(guó)家食品氨基酸測(cè)定方法[11]，采用OPA/FMOC（鄰苯二醛/9-芴甲基氯甲酸甲酯）全自動(dòng)柱前分析-AminoQuant氨基酸分析法測(cè)定鐵皮石斛原球莖氨基酸成分組成。

1.3.4 金屬元素含量測(cè)定 根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》元素檢測(cè)分析方法[12]，采用安捷倫電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Agilent 7500ce ICP-MS）對(duì)鐵皮石斛原球莖進(jìn)行元素含量的檢測(cè)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用Origin 8.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛的定向誘導(dǎo)和懸浮馴化

以野生鐵皮石斛莖段為材料，在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的瓊脂固體培養(yǎng)基中，經(jīng)45 d誘導(dǎo)培養(yǎng)，產(chǎn)生黃綠色顆粒狀愈傷組織（圖1-A）。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+2% 蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基上，經(jīng)40 d誘導(dǎo)，會(huì)形成 6～8 mm 鐵皮石斛原球莖（PLB）。為實(shí)現(xiàn)原球莖在固體培養(yǎng)基上的快速生長(zhǎng)，則可采用在1/2MS固體培養(yǎng)基中添加 2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭（圖2-B）的方法進(jìn)行快速增殖培養(yǎng)。