具抑菌活性乳酸菌篩選及抑菌活性物質分析

路則寶 王靚賢 姬志林

摘要：以大腸桿菌O157 ∶ H7為指示菌，采用spot-on-lawn法從食源性乳酸菌菌種庫中篩選獲得2株高抑菌活性乳酸菌，基于16S rRNA基因序列分析，分別鑒定為戊糖片球菌和發(fā)酵乳桿菌。利用改良牛津杯法測定2株乳酸菌發(fā)酵濃縮液對常見食源性病原菌的抑菌譜，并分析蛋白酶K、pH值、溫度對抑菌物質活性的影響，結果發(fā)現(xiàn)2菌株均能顯著抑制大腸桿菌和李斯特菌，其中戊糖片球菌發(fā)酵液具有更明顯廣譜抑菌效果;發(fā)酵液抑菌活性均受pH值影響，戊糖片球菌發(fā)酵液對蛋白酶、熱敏感，發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵液對蛋白酶、熱不敏感。研究結果表明，戊糖片球菌發(fā)酵液抑菌活性物質有多肽（蛋白）和有機酸，發(fā)酵乳桿菌來源的抑菌物質化學成分是一些具有熱穩(wěn)定性的有機酸。該研究獲得乳酸菌可以用于食品發(fā)酵和防腐領域，且為抑菌物質分離、鑒定和抑菌機制研究奠定基礎。

關鍵詞：乳酸菌;乳酸菌素;抑菌活性;抑菌譜

乳酸菌（lactic acid bacteria，簡稱LAB）是一類能發(fā)酵碳水化合物（主要指葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的主要菌群，長期定居于人類腸道并有益于人體健康，是公認的食品級安全微生物。LAB具有多種生理功能，比如促進營養(yǎng)物質吸收、維持腸道菌群平衡、提高人體免疫力等[1]。另外，經(jīng)過LAB發(fā)酵不僅可以增加食品的可消化性，賦予發(fā)酵食品特有風味、質地和結構，還能產(chǎn)生細菌素、過氧化氫、二氧化碳和有機酸等多種抑菌物質[2]?；贚AB安全性及其功能多樣性，LAB被廣泛用于食品發(fā)酵和生物保藏領域。隨著人民生活水平提高和食品安全意識增強，人們對食品的安全衛(wèi)生和自身健康狀況日益關注，天然食品和綠色食品更容易被消費者認可和接受，因此研究開發(fā)廣譜、高效、穩(wěn)定、安全的天然抗菌物質已成為當今國際食品防腐劑發(fā)展的主要方向。LAB來源的天然防腐劑，由于生產(chǎn)成本低廉、安全性高、抑菌效果好等原因，目前已成為研究熱點。

LAB主要通過產(chǎn)生酸性物質和乳酸菌素發(fā)揮抑菌作用。酸性物質是乳酸菌代謝的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，主要包括乙酸、乳酸等，酸性物質抑菌作用強弱取決于介質的pH值、酸的離解程度和酸的種類[2]。酸性物質是乳酸菌的主要抑菌物質，LAB主要通過產(chǎn)生酸性物質抑制食物中的部分致病菌和腐敗菌，馬妙蓮等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵上清液中抑菌有機酸包括乳酸、乙酸及少量的琥珀酸、檸檬酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸和亞油酸等[3]。乳酸菌素是乳酸菌合成分泌的對革蘭氏陽性菌發(fā)揮抑菌作用、部分對熱穩(wěn)定的蛋白或多肽，相關學者對乳酸菌素展開了較為深入的研究，華鶴良等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌素作用發(fā)揮受pH值、溫度條件影響，對水解蛋白酶具敏感性[4]，已被應用作為食品添加劑的乳酸鏈球菌素（Nisin），國內外有其許多結構與抗菌機制的報道[5]。

我國是一個乳酸菌資源種類豐富的國家，但對乳酸菌研究起步比較晚，雖然對乳酸菌的研究投入大量人力物力，也已經(jīng)有了很多新型乳酸菌生物制品在食品工業(yè)中的應用和大規(guī)模生產(chǎn)，但存在抑菌物質產(chǎn)量較少、抑菌活性不穩(wěn)定、抑菌譜較窄等問題，因此正確地選擇乳酸菌菌株是非常重要的。本研究目的為篩選優(yōu)良抑菌性狀的食源性乳酸菌，為乳酸菌優(yōu)良菌株及其抑菌代謝產(chǎn)物的開發(fā)和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和培養(yǎng)基

昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物室食品微生物菌種庫含有各種分離于傳統(tǒng)發(fā)酵食品（豆豉、泡菜、酸蘿卜等）的微生物，從中隨機取24株乳酸菌作為本試驗出發(fā)菌株。

食源性病原大腸桿菌（Escherichia coli）O157 ∶ H7，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）保存于昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物室，作為本試驗的指示菌株。

MRS液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.8%牛肉粉，0.4%酵母粉，2%葡萄糖，0.1%吐溫80，0.2% K2HPO4，0.5% NaAc，0.02% MgSO4，0.005% MnSO4，0.2%檸檬酸三銨，pH值6.2，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl，pH值7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

BHI液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白質胨，0.5% NaCl，0.25% Na2HPO4，0.2%葡萄糖，1.75%腦心浸出粉，pH值7.4，121 ℃ 高壓蒸汽滅菌15 min。

MRS、LB、BHI固體培養(yǎng)基：相應液體培養(yǎng)基中添加 1.5%～1.8%瓊脂。

水瓊脂：在去離子水中加2%瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 具有抑菌活性乳酸菌篩選

利用agar-spot-on law方法篩選具有抑菌活性的乳酸菌[6]。從-80 ℃冰箱中隨機選取24株乳酸菌，以1%（體積分數(shù)）比例分別接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，溫度為 37 ℃ 條件下中靜置培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物振蕩混勻，取 10 μL 滴加于MRS固體平板上，置于溫度為37 ℃條件區(qū)下培養(yǎng)24 h。將含有濃度為1×106 CFU/mL大腸桿菌 O157 ∶ H7 的LB固體培養(yǎng)基鋪在長有乳酸菌單菌落的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，觀察抑菌效果。

1.3 具有抑菌活性乳酸菌鑒定

選取上述抑菌效果最好的2株乳酸菌，利用細菌基因組提取試劑盒（中國百泰克公司）提取基因組DNA。以細菌16S rRNA基因為分子Marker，利用細菌通用引物F27（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和R1492（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送公司進行測序。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行同源性在線比對，鑒定菌種種屬[7-9]。

1.4 乳酸菌來源抑菌物質對常見食源性病原細菌抑制水平測定

將上述2株乳酸菌先在MRS液體培養(yǎng)基中過夜活化，然后按1%（體積分數(shù)）比例將活化菌液轉接至新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。離心（12 000 r/min，2 min）收集上清液，以9 mL/管分裝于50 mL離心管中，利用parafilm膜封住管口，然后先置于-80 ℃冰箱中過夜冷凍，再利用真空冷凍干燥機（100020，德國）冷凍干燥，最后用生理鹽水溶解固體粉末，得到濃度為0.5 g/mL的乳酸菌發(fā)酵上清濃縮液。利用改良牛津杯雙層平板法測定乳酸菌抑菌譜[3，10-11]。配制水瓊脂平板，并在瓊脂表面放置3個滅菌牛津杯。將3種常見食源性病原細菌（大腸桿菌O157 ∶ H7、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌）分別在LB、LB和BHI液體培養(yǎng)基中活化，然后將這3種病原菌分別加入冷卻至55 ℃的LB或BHI固體培養(yǎng)基中，使之濃度達到1×106 CFU/mL，搖勻后緩慢倒入已放置牛津杯的水瓊脂上，冷卻后取出牛津杯，孔中分別加入200 μL發(fā)酵上清濃縮液或未濃縮發(fā)酵上清液，溫度為 37 ℃ 過夜培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈大小。未接菌的MRS液體培養(yǎng)和發(fā)酵樣品平行試驗，得到的MRS液體培養(yǎng)基濃縮液作為對照。所有試驗均重復3次。

1.5 乳酸菌來源抑菌物質化學本質及作用特性

在乳酸菌發(fā)酵上清濃縮液中，加入工作濃度為1 mg/mL的蛋白酶K，45 ℃水浴酶解3 h，再65 ℃水浴20 min，使酶失活;向發(fā)酵上清濃縮液中加入適量1 mol/L NaOH，使其pH值為6.5;將發(fā)酵上清濃縮液分別置于65、80、100 ℃水浴鍋中處理1 h[12]。取200 μL經(jīng)蛋白酶K、NaOH和溫度處理的發(fā)酵上清濃縮液，用改良牛津杯法測定對大腸桿菌O157 ∶ H7、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的抑制水平。MRS液體培養(yǎng)基濃縮液與發(fā)酵上清濃縮液進行平行試驗，得到的液體作為對照。所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 具抑菌活性乳酸菌篩選與鑒定

大腸桿菌分別與24株乳酸菌共培養(yǎng)12 h后，觀察到16株乳酸菌有明顯抑菌效果。從中挑出9株抑菌效果相對較好的菌株再次進行篩選，篩選獲得2株抑菌效果最好的菌株，分別命名為KM9、KM19（圖1）。16S rRNA基因同源性分析發(fā)現(xiàn)，KM9、KM19分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）具有>99%同源性，說明KM9、KM19分別為戊糖片球菌、發(fā)酵乳桿菌。

2.2 乳酸菌來源抑菌物質抑菌譜分析

利用改良牛津杯法測定2株乳酸菌發(fā)酵上清濃縮液和未濃縮發(fā)酵上清液對3種常見食源性病原細菌的抑制作用，測定結果表明，未濃縮發(fā)酵上清液對所有病原菌均沒有抑制活性（數(shù)據(jù)未顯示），可能是未濃縮發(fā)酵上清液中抑菌物質含量過低。戊糖片球菌KM9、發(fā)酵乳桿菌KM19發(fā)酵上清濃縮液對大腸桿菌O157 ∶ H7和單核細胞增生李斯特菌均具有明顯抑制作用，相比較KM9對大腸桿菌O157 ∶ H7、單核細胞增生李斯特菌抑制效果較好，KM9對金黃色葡萄球菌有抑制效果而KM19則無（表1、表2、表3）。戊糖片球菌KM9發(fā)酵上清濃縮液不僅僅對食源性致病菌革蘭氏陽性單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌作用，也對革蘭氏陰性大腸桿菌O157 ∶ H7有較強的抑制作用，說明其產(chǎn)生的抑菌物質具有廣譜的抗菌活性。

由于乳酸菌菌株特異性，分泌的抑菌物質不同，使乳酸菌具有不同的病原菌抑菌譜;同一乳酸菌對不同病原菌具有不同的抑菌效果，可能跟病原菌的細胞結構組成相關。據(jù)相關報道[3，7，9-10，13]，分離的乳酸菌菌株產(chǎn)生的抗菌物質對大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等可以產(chǎn)生抑制作用，但抑菌譜有差異。馬妙蓮等從食用性小米分離得到的戊糖乳桿菌對大腸桿菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌及多種植物病原真菌產(chǎn)生抑菌作用[3]，熊駿等從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中分離的植物乳桿菌對鼠傷寒沙門菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等產(chǎn)生抑菌作用[7]，劉君等從魚、蝦腸道分離得到的戊糖片球菌對美人魚發(fā)光桿菌、大腸桿菌、溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌等都有不同程度的抑制作用[9]，胡彥新等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出產(chǎn)細菌素的香腸乳桿菌、乳酪短桿菌、植物乳桿菌對沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌具有抑菌作用[10]，任大勇等從發(fā)酵食品中分離出植物乳桿菌對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生抑菌作用[13]。

2.3 乳酸菌來源抑菌物質化學本質及作用特性

乳酸菌發(fā)酵上清濃縮液經(jīng)蛋白酶K處理后檢測結果表明，KM9來源抑菌物質對大腸桿菌O157 ∶ H7抑菌效果有所減弱，但對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的抑制活性幾乎未發(fā)生改變;KM19來源的抑菌物質對大腸桿菌 O157 ∶ H7 和單核細胞增生李斯特菌的抑制活性均未受影響（表1、表2、表3、圖2）。說明KM9來源抑菌物質中對大腸桿菌O157 ∶ H7作用成分中含有對蛋白酶敏感的蛋白物質，而對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的作用成分對蛋白酶不敏感。

發(fā)酵上清濃縮液pH值變成近中性（pH值6.5）時，KM9、KM19來源的抑菌物質對大腸桿菌O157 ∶ H7、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的抑制活性完全喪失（表1、表2、表3、圖2），說明KM9、KM19來源的抑菌物質化學成分應該是各種有機酸或酸性條件下發(fā)揮抑菌活性的多肽（蛋白）。

溫度敏感性試驗結果，高溫能降低戊糖片球菌KM9來源抑菌物質對大腸桿菌O157 ∶ H7和單核細胞增生李斯特菌的抑制能力（表1、表2、圖3），但對金黃色葡萄球菌抑制活性幾乎未受影響;KM19來源的抑菌物質對大腸桿菌O157 ∶ H7和單核細胞增生李斯特菌的抑制活性幾乎不受影響（表1、表2、表3、圖3）。結果表明KM9來源抑菌物質中對大腸桿菌O157 ∶ H7、單核細胞增生李斯特菌的作用成分對熱敏感，而對金黃色葡萄球菌作用成分對熱穩(wěn)定;KM19來源的抑菌物質對熱穩(wěn)定。

乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質種類繁多，不同乳酸菌產(chǎn)生不同的抑菌物質。張輝華等發(fā)現(xiàn)，乳酸菌不但對革蘭氏陽性菌有效，對革蘭氏陰性菌也有很強抑菌效果;并且抑菌物質對蛋白酶不敏感，推測其不是細菌素類物質，很可能是類抗生素物質[14]。李院等對來源于醬菜制品乳酸菌的抑菌物質進行分析，發(fā)現(xiàn)抑菌物質對熱穩(wěn)定，對pH值變化敏感，對蛋白酶處理亦表現(xiàn)不同敏感性，推測抑菌作用有效成分可能為小肽類/或有機酸[15]。何艷霞等從米粉發(fā)酵液、酒醅和老面酵頭中分離得到1株具有良好抑菌效果的乳酸菌，其抑菌物質活性具有熱穩(wěn)定性;高效液相色譜測定顯示，苯乳酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸是其主要抑菌物質，且苯乳酸對該菌抑菌活性貢獻較大[16]。田豐松等分離的菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌產(chǎn)生抑菌作用，堅強乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌和巴黎鏈球菌主要抗菌物質為有機酸，黏膜乳桿菌的抗菌物質為過氧化氫、蛋白和有機酸[17]。杜琨從西藏牧民酸奶中篩選出乳酸菌對金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等的抑制作用較好，認為抑菌機制主要是破壞菌體的細胞壁或膜的結構[18]。

綜合以上結果分析，KM9來源的抑菌物質化學成分主要是各種有機酸和小部分蛋白質，參與對大腸桿菌O157 ∶ H7和單核細胞增生李斯特菌作用的抑菌成分對溫度敏感，對金黃色葡萄球菌作用的成分主要是熱穩(wěn)定性的各種有機酸;KM19來源的抑菌物質化學成分應該是一些具有熱穩(wěn)定性的有機酸。

3 結論

本研究從24株來源于不同傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌中篩選獲得2株具有明顯抑菌活性的菌株，經(jīng)分子學鑒定為戊糖片球菌和發(fā)酵乳桿菌，分別命名為KM9、KM19。KM19能抑制大腸桿菌O157 ∶ H7和單核細胞增生李斯特菌，而KM9除了對這2種食源性病原細菌有作用外，對金黃色葡萄球菌同樣具有抑菌效果。另外，抑菌物質化學本質及作用特性初步研究發(fā)現(xiàn)，KM9來源的發(fā)酵濃縮液抑菌物質化學成分與KM19明顯不同，推測KM9來源的抑菌物質化學成分主要是各種有機酸和小部分蛋白質或肽，KM19來源的抑菌物質化學成分應該是一些具有熱穩(wěn)定性的有機酸。研究獲得的乳酸菌可以用于食品發(fā)酵和防腐領域，并豐富了乳酸菌應用菌種資源庫，且為后續(xù)抑菌物質的分離、鑒定和抑菌機制研究奠定了基礎。

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