基于正交投影偏最小二乘法對(duì)復(fù)方首烏藤合劑抗失眠作用的譜效關(guān)系研究

曾棋平，蔡小輝，吳坤林，楊麗娜，曹毅祥，陳錦珊

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院/廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州,363000)

中藥制劑具有高度的復(fù)雜性，通過(guò)多成分、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效作用。中藥的整體藥效是制劑中所含的“藥效物質(zhì)成分群”綜合作用的結(jié)果[1-3]。當(dāng)前，在眾多的中藥質(zhì)量控制方法中，指紋圖譜切實(shí)可行且被國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可。然而，藥效活性成分并不一定是指紋圖譜所體現(xiàn)的化學(xué)成分，含量高并不等于活性高。因此，單純的指紋圖譜還不能準(zhǔn)確全面評(píng)價(jià)中藥的成分與藥效之間的相關(guān)信息，存在一定的局限性[4]。近年來(lái)，譜效關(guān)系學(xué)已成為中藥研究的新領(lǐng)域[5-6]。中藥譜效關(guān)系就是以中醫(yī)藥理論研究為基礎(chǔ)，通過(guò)指紋圖譜與藥效之間的相互關(guān)系揭示中藥所含化學(xué)成分與藥效之間的相關(guān)性，最終確定相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，使構(gòu)建的指紋圖譜用于中藥質(zhì)量控制更具有針對(duì)性。

復(fù)方首烏藤合劑為廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院特色制劑，主要由首烏藤、合歡皮、五味子、蔓荊子、續(xù)斷、川芎、菟絲子、煅牡蠣八味藥材組成，具有清心安神、滋陰清肝、活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱性失眠[7-9]。雖該方臨床功效確切，但其整體復(fù)方的藥效成分群以及配伍的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)仍未闡明。本實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方首烏藤合劑的指紋圖譜與抗失眠作用，采用正交投影偏最小二乘法(orthogonal partial least square，OPLS)對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在尋找對(duì)抗失眠貢獻(xiàn)較大的藥效成分群，初步闡明該復(fù)方配伍的科學(xué)依據(jù)，以便更好地對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)；BT224S型電子分析天平(精度：0.1 mg，德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；PHS-3C型pH計(jì)(杭州雷磁分析儀器廠)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；H1650R高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；680型酶標(biāo)測(cè)試儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 藥物與試劑

對(duì)照品：五味子醇甲(批號(hào)：110857-201513，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、綠原酸(批號(hào)：110753-200413，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、鹽酸川芎嗪(批號(hào)：817-200104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；二苯乙烯苷(批號(hào)：GZDD-0506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、合歡皮木脂素苷(批號(hào)：GZDD-0817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、阿魏酸(批號(hào)：GZDD-0022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(批號(hào)：GZDD-0006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，均購(gòu)自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。藥材：首烏藤PolygonimultifloriCaulis(PMC，批號(hào)：20150828，產(chǎn)地：湖北)為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥藤莖，合歡皮AlbiziaeCortex(AC，批號(hào)：20170214，產(chǎn)地：湖北)為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹(shù)皮，菟絲子Cuscutaesemen(CS，批號(hào)：20160320，產(chǎn)地：內(nèi)蒙)為旋花科植物南方菟絲子CuscutaaustralisR.Br.或菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子，牡蠣(煅)Ostreaeconcha(OC，批號(hào)：20150605，產(chǎn)地：浙江)為牡蠣科動(dòng)物長(zhǎng)牡蠣OstreagigasThunberg大連灣牡蠣OstreatalienwhanensisCrosse或近江牡蠣OstrearivularisGould的貝殼，蔓荊子Viticisfructus(VF，批號(hào)：20150102，產(chǎn)地：江西)為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL.var.simplicifoliaCham.或蔓荊VitextrifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，續(xù)斷Dipsaciradix(DR，批號(hào)：20161107，產(chǎn)地：四川)為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，均購(gòu)自福建尤溪仙錦藥業(yè)有限公司；五味子SchisandraechinensisFructus(SCF，批號(hào)：201702374，產(chǎn)地：遼寧)為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)，川芎Chuanxiongrhizoma(CR，批號(hào)：201703358，產(chǎn)地：四川)為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，均購(gòu)自樟樹(shù)市慶仁中藥飲片有限公司；DL-4-氯苯丙氨酸[批號(hào)：A13323，阿法埃莎(中國(guó))化學(xué)有限公司]；0.9%氯化鈉注射液(100 ml/袋，自制)；碳酸氫鈉(批號(hào)：180425，上海虹光化工廠)；地西泮片(規(guī)格：2.5 mg，上海信誼藥廠有限公司)；聚山梨酯-80(批號(hào)：180801，四川金山制藥有限公司)，羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；大鼠5-羥色胺試劑盒(上海極威生物科技有限公司)；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，72只，體重(180±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、二苯乙烯苷、合歡皮木脂素苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、五味子醇甲對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱(chēng)取首烏藤18.75 g、合歡皮12.5 g、五味子4.17 g、蔓荊子 4.17 g、續(xù)斷12.5 g、川芎7.5 g、菟絲子12.5 g、煅牡蠣9.44 g，按表1的設(shè)計(jì)進(jìn)行回流提取，提取溶劑為水，最終均加水制成100 ml，搖勻，即得樣品溶液。精密量取樣品溶液5 ml，置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9。

表1 復(fù)方首烏藤合劑樣品制備工藝的正交試驗(yàn)分析

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1色譜條件

色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，2%～3%乙腈；10～35 min，3%～9%乙腈；35～50 min，9%～13%乙腈；50～65 min，13%～18%乙腈；65～85 min，18%～25%乙腈；85～100 min，25%～35%乙腈；100～107 min，35%～65%乙腈；107～118 min，65%～90%乙腈；118～120 min，90%～2%乙腈；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.3.2方法學(xué)考察

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液(S5)，按“2.3.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD均<1.0%，表明儀器精密度良好。取“2.2”項(xiàng)下同一供試品溶液(S5)，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD均<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。從同一提取液(S5)中按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD均<5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3指紋圖譜的建立及色譜峰的確定

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)軟件，以表1中S5樣品的色譜圖為參照譜，時(shí)間窗口設(shè)為0.5 min，選擇各圖譜中均含有且峰形相對(duì)好的色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，運(yùn)用平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜。結(jié)果從9張圖譜中篩選了21個(gè)特征峰(X0～X20)作為研究對(duì)象(圖1)，復(fù)方首烏藤藥材指紋圖譜色譜峰匹配數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖1 復(fù)方首烏藤合劑的HPLC指紋譜及其對(duì)照指紋譜(R)

峰面積樣品組S1S2S3S4S5S6S7S8S9X05487.588985.559962.618966.26469.327462.19780.638794.18794.1X12875.512855.395281.474577.354457.532936.374036.423439.973439.97X2896.651145.691240.841242.88832.75943.851121.931020.251020.25X31457.252623.12713.52281.191516.642254.123437.722444.992444.99

(續(xù)表2)

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠海馬體5-HT的含量

2.4.1DL-4-氯苯丙氨酸混懸液的制備

處方：DL-4-氯苯丙氨酸(PCPA)15 g，聚山梨酯80 2.0 g，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)3.0 g，0.9%氯化鈉注射液(pH7～8)加到500 ml。

制法：量取0.9%氯化鈉注射液500 ml于燒杯中，緩慢滴加5%碳酸氫鈉溶液，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH在7～8之間，加入CMC-Na，攪拌均勻，繼續(xù)加入處方量的PCPA和聚山梨酯-80，超聲15 min，于攪拌狀態(tài)下分裝于耐高溫的玻璃瓶?jī)?nèi)，蓋塞軋口密封，100℃流通蒸汽滅菌30 min。

2.4.2供試品溶液的制備

取“2.2”項(xiàng)下的9組復(fù)方首烏藤合劑各100 ml，分別濃縮至約80 ml，即得濃度(含生藥量)為1.0 g/ml的供試品溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3地西泮溶液的制備

取地西泮片劑10片，研磨成粉末，加純化水適量，充分?jǐn)嚢枋谷芙猓D(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，即得濃度為0.25 mg/ml的陽(yáng)性對(duì)照液。

2.4.4動(dòng)物分組、造模及給藥

將72只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為12組，分別為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、9批復(fù)方首烏藤合劑組，每組6只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，除了正常組外，對(duì)其余各組大鼠進(jìn)行腹腔注射PCPA(300 mg/kg)制作失眠模型，每日1次，連續(xù)2 d，在第1次腹腔注射PCPA的48 h后，大鼠出現(xiàn)白晝萎靡不振、食欲降低。而夜間活動(dòng)頻繁、興奮性增高、易激惹且攻擊性增強(qiáng)，對(duì)外界的聲光等刺激異常敏感。此外，大鼠尾部多處出現(xiàn)撕咬痕跡且破損出血，晝夜節(jié)律紊亂，表明造模成功。于第10天進(jìn)行灌胃給藥，正常組和模型組給予適量的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組和不同批次的復(fù)方首烏藤組給藥量分別為4.2 ml/kg和6.8 ml/kg，每天給藥1次，連續(xù)7 d。

2.4.5海馬體取材和含量測(cè)定

將大鼠放入裝有浸潤(rùn)乙醚(乙醚量為1～1.5 ml)棉球的標(biāo)本缸內(nèi)，觀察大鼠情況，待大鼠進(jìn)入麻醉期后，處死，固定于自制的手術(shù)木板置于解剖盤(pán)中，開(kāi)胸暴露并游離出心臟，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，切開(kāi)右心耳，先灌注無(wú)菌生理鹽水(4℃)，直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，再灌注4%多聚甲醛(4℃)，斷頭取腦，沖凈血液后，在冰上分離出各組大鼠的海馬組織，并稱(chēng)重，將組織進(jìn)行勻漿，于高速冷凍離心機(jī)離心(5 000×g)10 min，取上層清液，置于-80℃冰箱中保存，備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行5-羥色胺(5-HT)的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒具體要求進(jìn)行操作，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在吸收波長(zhǎng)450 nm處測(cè)得光密度(OD)值，復(fù)方首烏藤合劑鎮(zhèn)靜催眠藥效值為各組大鼠海馬體中5-HT的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組失眠大鼠海馬體中的5-HT含量

*P<0.05，與模型組比較

2.5 譜效關(guān)系的偏最小二乘回歸分析

2.5.1偏最小二乘回歸方程的建立

以標(biāo)準(zhǔn)化處理的指紋圖譜中各特征峰峰面積為自變量X，以各組失眠大鼠海馬體中的5-HT含量水平為因變量Y，采用SIMCA-P 14.1軟件對(duì)其進(jìn)行OPLS回歸分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，得方程：

Y=0.064 0X0+0.086 7X1+0.052 4X2-0.025 3X3-0.051 6X4-0.078 6X5+0.038 4X6+0.094 5X7+ 0.066 0X8- 0.018 3X9+ 0.066 1X10-0.067 8X11+0.050 8X12-0.124 5X13+0.010 4X14-0.061 4X15-0.077 4X16-0.032 8X17-0.101 0X18+0.001 3X19+0.019 0X20

式中,系數(shù)越大表明該自變量對(duì)藥效影響越大，并且系數(shù)為正值說(shuō)明其與藥效呈正相關(guān)，負(fù)數(shù)則表示與藥效呈負(fù)相關(guān)。

2.5.2變量投影重要性分析

變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)是反映自變量對(duì)因變量解釋能力的1個(gè)重要指標(biāo)，其值越大說(shuō)明該自變量對(duì)因變量的解釋能力越強(qiáng)。一般認(rèn)為，當(dāng)VIP值>1時(shí)，自變量在解釋因變量時(shí)具有顯著重要性，VIP分析結(jié)果見(jiàn)圖3。OPLS回歸分析結(jié)果表明X1、X4、X5、X8、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16和X18的VIP值均>1，排序?yàn)閄8>X16>X12>X5>X18>X1>X9>X15>X4>X10>X13>X14，其中X1、X10、X12、X14與5-HT含量水平呈正相關(guān)，而X1、X10、X12的VIP值較大，當(dāng)它們含量增加時(shí)，復(fù)方首烏藤合劑提高5-HT水平的能力則會(huì)顯著增強(qiáng)；X4、X5、X8、X9、X13、X15、X16、X18與5-HT水平呈負(fù)相關(guān)，X8、X16、X5、X18的回歸系數(shù)和VIP絕對(duì)值均較大，當(dāng)它們含量增加時(shí)，復(fù)方首烏藤合劑提高5-HT水平的能力則會(huì)減弱。

圖2 復(fù)方首烏藤合劑抗失眠譜效相關(guān)性的PLSR模型回歸系數(shù)

圖3 各特征峰對(duì)復(fù)方首烏藤合劑抗失眠活性的VIP貢獻(xiàn)

2.5.3色譜峰的成分鑒定

采用已有對(duì)照品進(jìn)行HPLC分析，匹配出X4為鹽酸川芎嗪，X8為綠原酸，X11為阿魏酸，X12為二苯乙烯苷，X13為合歡皮木脂素苷，X17為川續(xù)斷皂苷Ⅵ，X19為五味子醇甲，見(jiàn)圖4。

圖4 混合對(duì)照品的HPLC圖 X4.鹽酸川芎嗪；X8.綠原酸；X11.阿魏酸；X12.二苯乙烯苷；X13.合歡皮木脂素苷；X17.川續(xù)斷皂苷Ⅵ；X19.五味子醇甲

3 討論

中藥組分復(fù)雜，其療效的發(fā)揮為多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，單一或幾個(gè)化學(xué)成分的定量檢測(cè)難以全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的優(yōu)劣。譜效關(guān)系研究實(shí)際上是數(shù)學(xué)相關(guān)分析與藥學(xué)的一個(gè)交叉應(yīng)用，如何進(jìn)行譜效關(guān)系研究尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)和適用模式。分析方法主要有最小二乘法分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、聚類(lèi)分析等[10-12]。本試驗(yàn)采用的正交投影偏最小二乘法是一種改進(jìn)的偏最小二乘法，能有效去除預(yù)測(cè)矩陣中與因變量無(wú)關(guān)的信息，改善了模型的解釋性和真實(shí)性[13]。研究結(jié)果顯示，復(fù)方首烏藤合劑抗失眠作用中有12個(gè)成分較為重要，也解釋了該合劑抗失眠作用并非某一具體成分的藥效，而是多成分協(xié)同起效的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)選用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，所得的HPLC圖譜基線平穩(wěn)，共有色譜峰數(shù)目較多，各主要成分峰分離度較好。采用DAD檢測(cè)器在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)在210 nm時(shí)色譜峰數(shù)量較多，整體圖譜較為勻稱(chēng)，因此將210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于5-HT是一種重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種行為情緒活動(dòng)尤其是睡眠的調(diào)節(jié)，大鼠腹腔注射PCPA后，可選擇性地阻斷腦內(nèi)5-HT的合成。PCPA誘導(dǎo)的大鼠失眠模型具有造模時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行、造模成功率高、病變典型、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的失眠模型[14]。因PCPA溶解度差，直接采用弱堿性生理鹽水(pH7～8)溶解會(huì)導(dǎo)致混懸液易沉降、注射劑量不準(zhǔn)確、堵塞注射器等問(wèn)題。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[15]，通過(guò)添加聚山梨酯-80和CMC-Na等助懸劑，配制的PCPA混懸液微粒大小均勻、沉降速度慢，具有良好的再分散性。

中藥指紋圖譜可以反映藥材多種化學(xué)成分的整體性差異，而生物評(píng)價(jià)既關(guān)聯(lián)臨床功效又關(guān)聯(lián)機(jī)制。因此，將化學(xué)指紋圖譜與生物活性評(píng)價(jià)相結(jié)合，構(gòu)建基于化學(xué)指紋圖譜與藥效的綜合評(píng)控模式有利于對(duì)中藥制劑進(jìn)行更合理的評(píng)控[16]。通過(guò)基于譜效相關(guān)性的研究，課題組發(fā)現(xiàn)復(fù)方首烏藤合劑中的3個(gè)成分對(duì)其抗失眠作用貢獻(xiàn)度較高，初步探討了其抗失眠的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，通過(guò)對(duì)照品匹配，僅指認(rèn)出7個(gè)色譜峰，與活性顯著相關(guān)的色譜峰指認(rèn)出1個(gè)(二苯乙烯苷)，在后續(xù)研究中，將通過(guò)Q-TOF或LC-MS/MS等研究手段對(duì)未知色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以進(jìn)一步明確復(fù)方首烏藤合劑中與抗失眠活性相關(guān)的活性成分。