用HPLC法測(cè)定百蕊草中3個(gè)黃酮苷的含量

宣偉東，成 熙，葉曙娜，徐德東

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200081)

百蕊草ThesiumchinensisTurcz，為檀香科百蕊草屬多年生寄生草本，別名細(xì)須草、一棵松、青龍草等，常附著在其他活體植物根上生長(zhǎng)，在我國(guó)分布較廣，主要產(chǎn)地為安徽、浙江和湖北等省。百蕊草性寒，味辛、澀，歸肺、腎二經(jīng)，有清熱解毒、補(bǔ)腎固精之功效，現(xiàn)代藥理研究表明，百蕊草具有良好的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[1-2]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，百蕊草水提取物對(duì)腎病綜合征大鼠和IgA腎病大鼠均有良好的治療效果[3-4]，其水提物經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附后，中等極性的洗出物是其抗炎活性部位[5]。進(jìn)一步的化學(xué)成分分離純化研究表明，以山奈酚為母核的黃酮苷類化合物是活性部位的主要化學(xué)成分[6]。其中，含量較高的3個(gè)黃酮苷類化合物分別是：山奈酚-3-O-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(百蕊草素Ⅰ)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(紫云英苷)、山奈酚-3-O-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[6-O-乙酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷(6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ)。筆者采用HPLC法，以外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定百蕊草全草中上述3個(gè)黃酮苷類化合物的含量，為百蕊草及其制劑的研究提供一種簡(jiǎn)便、快速的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC-10AT色譜泵、SPD-10A紫外檢測(cè)儀(日本島津公司)，N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)，AB104-N電子分析天平(梅特勒-托利多)。DIKMA C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。對(duì)照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ均由本課題組從百蕊草水提取物中等極性部位分離純化得到，HPLC純度測(cè)定含量>98.5%[6]。3批百蕊草產(chǎn)地分別為：湖北荊州(安徽亳州中藥材市場(chǎng),批號(hào)：20150510)、安徽池州(安徽亳州中藥材市場(chǎng),批號(hào)：20150518)、河南泌陽(yáng)(金滿農(nóng)場(chǎng)，批號(hào)：20150915)，均由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室孫蓮娜副教授鑒定為檀香科百蕊草屬百蕊草ThesiumchinensisTurcz的干燥全草。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ對(duì)照品，經(jīng)105 ℃減壓干燥至恒重。分別精密稱定上述對(duì)照品各20、4、8 mg，分別置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取上述3種對(duì)照品溶液各10 ml，置于同一容量瓶中，混勻，即得對(duì)照品混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取干燥百蕊草全草藥材，剪成1～2 cm小段。

取上述藥材10 g，放入圓底燒瓶中，加入50%乙醇適量，水浴加熱回流提取2次，每次1 h。合并提取液，減壓回收至無醇味。濃縮液轉(zhuǎn)移至100 ml分液漏斗，用20 ml水混懸，用石油醚(10 ml)萃取2次。水層減壓回收成浸膏，加50%乙醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，再用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液適量，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱:DIKMA C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(21∶79,V/V)，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.61；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：346 nm。對(duì)照品混合溶液和供試品溶液各進(jìn)樣20 μl，分別記錄色譜圖，各組分理論塔板數(shù)均>3 000，分離度>1.5，色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

以濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表2。

圖 1 對(duì)照品及供試品溶液的HPLC圖 A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液 1.百蕊草素Ⅰ；2.紫云英苷；3.6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ

序號(hào)百蕊草素Ⅰμg/mlX-紫云英苷紫云英苷μg/mlX-6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰμg/mlX-1200135131240408658.380346103.52100682344.520202105.940171401.2350346551.610102179.62087646.4425172325.45.052171.81045186.6512.5903882.526366.45.023100.4

表2 各對(duì)照品線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取線性關(guān)系考察項(xiàng)中序號(hào)3對(duì)照品混合溶液(百蕊草素Ⅰ:50 μg/ml、紫云英苷:10 μg/ml、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ:20 μg/ml)，進(jìn)樣20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。對(duì)照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的平均峰面積分別為366 795.9、971 50.82、746 25.32，RSD(n=6)分別為1.08%、1.20%、1.77%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液Ⅰ(批號(hào)：20150510)，分別于0、2、4、8、12、24 h按上述色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖和各成分峰面積。供試品中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的平均峰面積分別為408 302.5、107 108.6、904 45.45，RSD(n=6)分別為0.85%、1.32%、2.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次百蕊草藥材6份(批號(hào)：20150510)，每份各約10.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各進(jìn)樣20 μl，分別記錄色譜圖和各成分峰面積。各供試品中百蕊草素Ⅰ、 紫云英苷、 6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的平均峰面積分別為335 104.2、110 128、819 38.33，RSD(n=6)分別為2.43%、2.22%、1.72%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

依據(jù)重復(fù)性考察結(jié)果，按外標(biāo)法計(jì)算10.0 g百蕊草中(批號(hào)：20150510)百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的含量分別為：45.7、1.1、2.2 mg。取上述百蕊草藥材6份，每份約5.0 g，分別置于圓底燒瓶中，每份中均加入干燥的對(duì)照品百蕊草素Ⅰ(22.9 mg)、紫云英苷(0.55 mg)和6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ(1.1 mg)，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液并按上述色譜條件進(jìn)樣20 μl進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分平均回收率(n= 6)。結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批百蕊草藥材(批號(hào)：20150510、20150518、20150925)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。供試品溶液和對(duì)照品混合溶液各進(jìn)樣20 μl測(cè)定，記錄峰面積。采用外標(biāo)法分別計(jì)算3批百蕊草藥材中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的含量。結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=6)

表4 百蕊草中3種成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的百蕊草藥材以及上市制劑“百瑞含片”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中[7-8]，多以山奈酚為測(cè)定指標(biāo)。因山奈酚在百蕊草中含量極低，故采用酸水解法提取藥材后制備供試品溶液，以提高山奈酚的含量。經(jīng)酸水解之后制備的供試液中，山奈酚的含量已非藥材天然含有的水平，不能真實(shí)反映藥材及制劑中真實(shí)的含量。且酸水解為化學(xué)反應(yīng)，可帶來不可預(yù)知的副反應(yīng)及其他產(chǎn)物，水解時(shí)的pH值、時(shí)間和溫度等因素均會(huì)導(dǎo)致水解程度不同，影響含量的準(zhǔn)確性。有報(bào)道提示，選用50%乙醇溶液回流提取2次，每次1 h，紫云英苷的提取率最高[7]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的3個(gè)黃酮苷類化合物為紫云英苷及其衍生物，結(jié)構(gòu)中均含有糖分子，在含水溶劑中溶解度較大，不溶于低極性的有機(jī)溶劑。因此，在供試品溶液制備時(shí)，選用50%乙醇溶液提取2次，并用石油醚萃取提取液，去除極性較小的成分，從而排除脂溶性成分對(duì)液相色譜的干擾。

通過對(duì)混合對(duì)照品溶液的紫外掃描，分別在265、346、378 nm處出現(xiàn)山奈酚的特征吸收峰。由于265 nm處多數(shù)成分均有吸收，專屬性不強(qiáng)，對(duì)基線干擾大，而368 nm的吸光度較小，故采用346 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，可以獲得分離度較好的HPLC圖譜。基于有文獻(xiàn)采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定百蕊草中山奈酚、百蕊草素Ⅰ及百蕊草素Ⅱ的含量，采用相對(duì)校正因子計(jì)算和外標(biāo)法測(cè)定3個(gè)成分的含量無顯著差異[9]，故本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法直接測(cè)定含量。

在百蕊草活性成分分離純化的基礎(chǔ)上，以3個(gè)黃酮苷化合物為對(duì)照，采用HPLC法，對(duì)湖北、安徽、河南產(chǎn)地的3批全草進(jìn)行了活性成分的含量測(cè)定，首次建立了一次同時(shí)測(cè)定百蕊草中3個(gè)黃酮苷類組分的方法，可為百蕊草及其制劑的質(zhì)量控制提供一種新的、簡(jiǎn)便、快速的分析手段。