T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子在兒童免疫性血小板減少癥轉(zhuǎn)歸中的意義

王欣欣，劉 豹，郭路陽，范 蕊，任瑞娟，李培嶺，石太新

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，河南 衛(wèi)輝 453100)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic，ITP)是兒童最常見的出血性疾病，發(fā)病率為(4～5)/10萬[1]。ITP是一種自身免疫性疾病，以皮膚及黏膜自發(fā)性出血、血小板減少為主要臨床特點，大多數(shù)兒童ITP為自限性，在診斷后12個月內(nèi)血小板計數(shù)可恢復(fù)正常，約10%～20%的患兒轉(zhuǎn)變?yōu)槁訧TP或難治性ITP[2]，可能與免疫功能持續(xù)紊亂有關(guān)。慢性ITP或難治性ITP患兒治療時間長，療效差，病情易反復(fù)，出血風(fēng)險增加，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。如能在發(fā)病初期或治療過程中預(yù)測ITP患兒病程，可為患兒制定個體化治療方案提供依據(jù)。國內(nèi)外多項研究根據(jù)ITP患兒臨床及實驗室特征預(yù)測其病程，分析影響兒童ITP的預(yù)后因素[2-3]。但關(guān)于T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子對兒童ITP病程及預(yù)后影響的研究較少，本研究采用流式微球陣列技術(shù)(cytometric bead array，CBA)檢測ITP患兒外周血T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平，探討其在兒童ITP預(yù)后評估中的作用及意義；現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年7月至2017年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科收治的108例ITP患兒為研究對象，其中男62例，女46例，年齡 1～156個月，中位年齡31個月。所有患兒符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且均行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查，隨訪12個月以上，臨床及隨訪資料完整。根據(jù)隨訪結(jié)果評估患兒疾病轉(zhuǎn)歸，并將患兒分為新診斷ITP組(病程<3個月)、持續(xù)性ITP組(病程3～12個月)、慢性ITP組(病程>12個月)[4]。另選擇本院同期體檢健康兒童40例為對照組，男25例，女15例，年齡1.7～140.0個月，中位年齡55個月。納入研究前2周內(nèi)無感染病史，4周內(nèi)無輸血、疫苗接種史，未使用過葉酸、維生素B12、維生素B6。本研究已獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號2017067)，均經(jīng)受試者監(jiān)護人同意后參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑檢測設(shè)備為美國BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀。檢測試劑為美國BD公司Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子試劑盒。

1.2.2 標(biāo)本采集及檢測所有受試者于入院當(dāng)天無菌采集外周血2 mL，慢性ITP組患兒治療后12個月再次采集外周血2 mL，室溫下放置20～30 min，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，-80 ℃凍存。采用CBA技術(shù)檢測受試者血清白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A水平，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 各組受試者T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較結(jié)果見表1。新診斷ITP組、持續(xù)性ITP組、慢性ITP組患兒血清IL-2、IL-17A水平高于對照組，慢性ITP組患兒血清IL-2水平高于新診斷ITP組、持續(xù)性ITP組，慢性ITP組患兒血清IL-17A水平高于新診斷ITP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；新診斷ITP組、持續(xù)性ITP組、慢性ITP組患兒血清IL-4、IL-10水平低于對照組，慢性ITP組患兒血清IL-4、IL-10水平低于新診斷ITP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；4組受試者血清IFN-γ、TNF、IL-6水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 4組受試者T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

注：與對照組比較aP<0.05；與新診斷ITP組比較bP<0.05；與持續(xù)性ITP組比較cP<0.05。

2.2 慢性ITP患兒治療前與治療后12個月T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較結(jié)果見表2。慢性ITP患兒治療后12個月血清IL-2、INF-γ、TNF、IL-6及IL-17A水平較治療前下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，血清IL-4及IL-10水平較治療前升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 慢性ITP患兒治療前和治療后12個月 T淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

3 討論

ITP 是一種免疫介導(dǎo)的出血性疾病，其發(fā)病機制尚未完全明確，目前認(rèn)為與機體細(xì)胞免疫和體液免疫異常有關(guān)。近年來，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂在ITP中的致病作用已成為共識[5-7]，活化的T細(xì)胞可直接刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生血小板自身抗體，加速血小板破壞，使血小板數(shù)目減少；另外，T細(xì)胞還可抑制骨髓巨核細(xì)胞的活性，使其產(chǎn)血小板功能降低。T細(xì)胞主要包括輔助性T細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulating T lymphocyte，Treg)。Th細(xì)胞構(gòu)成機體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，根據(jù)分泌細(xì)胞因子的作用不同分為Th1、Th2和Th17細(xì)胞，其中最重要的是Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-β主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞通過細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10和IL-13的合成誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。在正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞的作用是維持免疫穩(wěn)態(tài)，二者互相聯(lián)系、互相抑制，其動態(tài)平衡在維持機體正常狀態(tài)方面具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者體內(nèi)存在Th1/Th2比例失調(diào)，但是Th1還是Th2起主導(dǎo)作用尚不確定。李培嶺等[8]研究發(fā)現(xiàn)，急性ITP患兒血清中IFN-γ水平明顯增加，IL-4水平降低，IFN-γ與IL-4呈負(fù)相關(guān)，呈Th1優(yōu)勢。另有文獻(xiàn)報道，慢性ITP患者的Th1/Th2比例升高，呈Th1優(yōu)勢，但經(jīng)過丙種球蛋白或激素治療或處于緩解期患者的Th1/Th2比例下降，趨向Th2優(yōu)勢[9]。李文倩等[10]通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定ITP患者Th1及Th2細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，ITP患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ水平與健康體檢者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-4、IL-6水平高于健康體檢者，更傾向于Th2優(yōu)勢。也有研究發(fā)現(xiàn)，慢性ITP患者血清中Th1細(xì)胞因子水平降低，Th2細(xì)胞因子水平顯著升高[11]，表現(xiàn)為Th2優(yōu)勢反應(yīng)。

本研究通過CBA技術(shù)檢測ITP患兒Th1及Th2細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，新診斷ITP組、持續(xù)性ITP組、慢性ITP組患兒Th1細(xì)胞因子IL-2水平較對照組明顯升高，慢性ITP組患兒血清IL-2水平高于新診斷、持續(xù)性ITP組；新診斷ITP組、持續(xù)性ITP組、慢性ITP組患兒Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平較對照組明顯降低，慢性ITP組患兒血清IL-4、IL-10水平低于新診斷ITP組；4組受試者血清IFN-γ、TNF、IL-6水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITP患兒血清Th1細(xì)胞因子IL-2呈高水平，Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平顯著下降，即在ITP患兒中存在Th1/Th2失衡，趨向Th1優(yōu)勢型，且這一優(yōu)勢在慢性ITP患兒尤為顯著，考慮可能與疾病呈慢性發(fā)展及ITP患兒體內(nèi)存在免疫功能紊亂有關(guān)，而慢性ITP患兒則存在更嚴(yán)重的免疫紊亂。

Th17細(xì)胞是一類新型CD4+T細(xì)胞亞群，其特征在于產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-17的能力，IL-17可以通過誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α)及趨化因子(如單核細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2)的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞對局部的浸潤及組織損傷，同時IL-17參與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的增殖、成熟及分化過程，以此加強固有免疫與獲得性免疫之間的聯(lián)系。但其是否參與ITP發(fā)病過程，是否與ITP發(fā)病機制中的Th1/Th2比例失衡存在聯(lián)系，仍存在爭議。YE等[12]和WANG等[13]報道顯示，ITP患者體內(nèi)Th17細(xì)胞比例、血漿IL-17水平升高，單個核細(xì)胞內(nèi)IL-17A mRNA表達(dá)水平也顯著增加。MA等[11]研究表明，與年齡、性別匹配的健康成年人比較，ITP患者血漿IL-17水平顯著降低，且重型ITP患者IL-17水平顯著低于慢性ITP患者。而MA等[14]和GUO等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平與健康志愿者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Th17細(xì)胞可能在ITP發(fā)病中無明顯作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，新診斷ITP組、持續(xù)性ITP組、慢性ITP組患兒血清IL-17A水平明顯升高，慢性ITP組患兒IL-17A水平高于新診斷ITP組，提示ITP患兒體內(nèi)存在Th17細(xì)胞因子失衡，以IL-17A水平升高為主，且慢性ITP患兒更顯著，提示IL-17A可能參與了兒童ITP的發(fā)病，且與疾病呈長病程有關(guān)，與ROCHA等[16]研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果還顯示，慢性ITP組患兒治療后12個月，血清IL-2、TNF、INF-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A水平與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。馬靜瑤等[17]研究提示，兒童ITP病程的遷延可能與治療后血清IL-2、TNF水平持續(xù)不降、IL-4和IL-10持續(xù)不升高有關(guān)，考慮Th1細(xì)胞持續(xù)過度活化。因此，在IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A的共同作用下，慢性ITP患兒體內(nèi)免疫紊亂持續(xù)存在，這可能是ITP患兒預(yù)后不良、呈現(xiàn)病程遷延的原因之一。細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A可能能夠反映ITP患者臨床預(yù)后情況。

綜上所述，ITP患兒血清Th1細(xì)胞因子IL-2、Th17細(xì)胞因子IL-17A水平升高，Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平降低，慢性患兒更顯著，提示可能與疾病呈慢性發(fā)展有關(guān)，有助于判斷ITP患兒病情轉(zhuǎn)歸，對評估臨床預(yù)后有指導(dǎo)意義。