CD34+CD38-KG1a白血病干細胞對同種異體自然殺傷細胞的抵抗作用及其機制

王國征，吳遠彬，郭坤元，代喜平

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院血液科，廣東省中醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510120)

急性白血病是人類最常見的惡性腫瘤，白血病干細胞(leukemia stem cell，LSC)是其復發(fā)和難治根源之一[1-2]。LSC在多個基因和信號調節(jié)系統(tǒng)上發(fā)生異常，失去正常的增殖分化能力，具有很強的無控性自主增殖能力，能夠對藥物、放射和免疫細胞的殺傷產生強大的抵抗力[3]。研究表明，從急性髓系白血病細胞株KG1a中分選的CD34+CD38-KG1a具有LSC生物學特性，可抵抗化學藥物的殺傷作用[4]。本研究擬探討CD34+CD38-KG1a對自然殺傷(natural killer，NK)細胞的抵抗作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、試劑和儀器人急性髓系白血病細胞株K562由本實驗室凍存，KG1a細胞株由中國醫(yī)學科學院血液病研究所惠贈，本實驗室傳代保存；PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，淋巴細胞分離液購自天津血液研究所，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)殺傷活性試劑盒購自美國Promega公司，抗主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)-I類鏈相關分子A/B(MHC class I chain-related molecules A and B，MICA/B)單抗、抗人巨細胞病毒UL16結合蛋白(human cytomegalovirus glycoprotein UL16 binding proteins，ULBP)1單抗、抗ULBP2單抗、抗ULBP3單抗、抗人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) -Ⅰ類分子抗體、CD38-異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、抗-FITC免疫磁珠、抗CD16CD56免疫磁珠購自德國MiltenyiBiotec公司，殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(inhibitory killer cell immunoglobulin- like receptor，KIR)基因檢測試劑盒、HLA基因檢測試劑盒購自德國Biotest公司；精密加樣槍購自美國Apendorff公司，免疫磁珠細胞分選儀(immune magnetic bead separator，MACS)、LD分離柱購自德國Miltenyi Biotec公司，ELX800光吸收酶標儀購自美國Bio-TeK公司，Eppendorf高速低溫離心機購自美國Fisher Scientific公司，流式細胞儀購自美國Coulter公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，Olympus倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，一次性100 cm2培養(yǎng)瓶、試管、96孔培養(yǎng)板購自美國Corning公司，血球計數(shù)板購自上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)37 ℃水浴箱中溶解凍存的K562、KG1a細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重懸浮細胞于4 mL含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于 37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進行孵育。

1.3 免疫磁珠法分選CD34+CD38-KG1a細胞取對數(shù)生長期KG1a細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，每107個細胞加100 μL PBS和帶FITC的CD38抗體10 μL，4 ℃下避光孵育30 min。PBS洗滌1次，棄上清液，重懸浮細胞，每107個細胞加PBS 9 μL和抗FITC的免疫磁珠10 μL，混勻后4 ℃下孵育15 min，PBS再洗滌1次，棄上清液，重懸于5 mL分選液中，將LD柱安裝在磁鐵中，取2 mL分選液濕潤LD分離柱，細胞懸液加入LD柱中，每次加入1 mL緩沖液，沖洗2次，無菌試管收集分離的CD34+CD38-KG1a細胞。每106個細胞加1 μg單抗，4 ℃下孵育30 min，加PBS 2 mL，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，重新懸浮細胞，流式細胞儀檢測分離細胞的純度。

1.4 同種異體NK細胞分離采用梯度密度沉淀法分離4例健康個體外周血單個核細胞，PBS洗滌后，每107個細胞加緩沖液80 μL和抗NK細胞免疫磁珠20 μL，4 ℃下孵育15 min，每107個細胞加緩沖液1 mL，離心，棄上清。每108個細胞加緩沖液500 μL重新懸浮細胞，置于Mini-MACS磁場中進行分離，一次性試管收集CD3陰性細胞，再次用 500 μL 緩沖液沖洗分選的CD56陽性細胞，共2次，卸下分選柱，加RPMI-1640培養(yǎng)液 1 mL，推注器推出陽性細胞，分選的CD3-CD16+CD56+細胞即為NK細胞。PBS洗滌2次，每106個細胞加CD3FITC/CD16CD56PE單抗1 μg，4 ℃孵育 30 min，加入PBS 2 mL，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清后重懸細胞，以同型的IgG為對照，采用流式細胞術檢測NK細胞數(shù)。

1.5 NK細胞對K562細胞和CD34+CD38-KG1a細胞的殺傷作用以NK細胞為效應細胞，以對數(shù)生長期K562細胞為靶細胞對照，分離的CD34+CD38-KG1a細胞為靶細胞，RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞密度為2×108L-1，加入96孔板中，每孔 50 μL。將細胞分為效靶組、效應細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組、靶細胞最大釋放組和空白對照組。效靶組按不同效靶比(5：1、10：1、20：1)分別加入不同濃度的NK細胞各50 μL；效應細胞自發(fā)釋放組加入NK細胞50 μL、RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL；靶細胞自發(fā)釋放組加入靶細胞50 μL、RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL；靶細胞最大釋放組加入裂解液10 μL、靶細胞50 μL、RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL；空白對照組加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。各組均設4個復孔，于37 ℃下在含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，2 000 r·min-1離心5 min，吸取 50 μL 上清，加入96孔平底酶標板中，加LDH底物反應液50 μL，室溫下避光放置30 min，每孔加 50 μL 終止液終止反應。酶標儀測波長490 nm 處吸光度值。計算NK細胞殺傷活性。殺傷率=(效靶組平均吸光度值-靶細胞自然釋放組平均吸光度值-效應細胞自然釋放組平均吸光度值)/(靶細胞最大釋放組平均吸光度值-靶細胞自然釋放組平均吸光度值)×100%。

1.6 NK細胞KIR和CD34+CD38-KG1a細胞HLA-Ⅰ基因分型采用聚合酶鏈式反應-序列特異性引物法(polymerase chain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP)進行NK細胞KIR和CD34+CD38-KG1a細胞HLA-Ⅰ基因分型，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

融化試劑盒配備PCR緩沖液，震蕩混勻，每管1份(150.0 μL)；取出Taq酶置于冰盒上；加60 μL蒸餾水和2.4 μL Taq酶于備用的PCR緩沖液管，震蕩混勻。取上述混合液8 μL加至污染監(jiān)控孔(對照孔)。加25 μL提純的DNA標本至剩余的混合液中，震蕩均勻；除對照孔外，每孔加上述混合液 8 μL，用密封條密封試劑板。放入PCR儀進行擴增，擴增程序：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性20 s，63 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)。4 ℃終止反應。5×Tris-硼酸緩沖液制備20 g·L-1的瓊脂糖凝膠，冷卻至60 ℃時，每100 mL TBE加2 μL 10 g·L-1的溴化乙錠，電泳槽中鋪好膠后放置梳子，冷卻。去掉PCR試劑板上的密封條，加入6 μL PCR產物于電泳膠孔內。以ONELAMBDA gel box 120V恒壓電泳25 min，將凝膠取出置紫外燈下拍照觀察。

1.7 K562細胞和CD34+CD38-KG1a細胞表面NKG2D配體及HLA-Ⅰ分子的表達取對數(shù)生長期K562細胞和分選的CD34+CD38-KG1a細胞，PBS洗滌，計數(shù)，分管，直接標記法檢測HLA-Ⅰ類分子，每106個細胞加入1 μg W6/32，4 ℃培育 30 min，PBS洗滌3次。間接標記法檢測NKG2D配體的表達，每106個細胞加入抗MICA/B單抗，抗ULBP1單抗，抗ULBP2單抗，抗ULBP3單抗，抗HLA-Ⅰ 單抗一抗各1 μg，4 ℃下作用30 min，PBS洗滌后再加入FITC標記的山羊抗鼠IgG(稀釋度1：100)二抗，4 ℃培育30 min，PBS洗滌后上機，以同型IgG抗體作為陰性對照。流式細胞儀分析1×104個細胞中陽性細胞數(shù)，計算百分率。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 CD34+CD38--KG1a和NK細胞的純度結果見圖1。分選的CD34+CD38--KG1a細胞和NK細胞純度分別為(94.25±2.16)%、(91.70±2.05)%。

A：NK細胞分選前；B：NK細胞分選后；C：CD34+CD38-KG1a 細胞分選前；D：CD34+CD38-KG1a 細胞分選后。

2.2 NK細胞對K562和CD34+CD38-KG1a細胞的殺傷作用結果見表1。NK細胞在各效靶比下對CD34+CD38-KG1a細胞的殺傷率均低于K562細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 NK細胞對K562和CD34+CD38-KG1a細胞殺傷情況

2.3 NK細胞KIR和CD34+CD38-KG1a細胞的HLA-Ⅰ基因分型結果見圖2和圖3。4例健康個體NK細胞KIR基因型KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2；CD34+CD38-KG1a細胞HLA-Ⅰ基因型為A30、30，B51、78，Cw4、16。

圖2 NK細胞KIR基因分型

圖3 CD34+CD38-KG1a細胞HLA基因分型

2.4 K562和CD34+CD38-KG1a細胞中NKG2D配體及HLA-Ⅰ類分子的表達率結果見表2。K562細胞高表達NKG2D配體，CD34+CD38-KG1a細胞幾乎不表達NKG2D配體，K562細胞中NKG2D配體表達率顯著高于CD34+CD38-KG1a細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；K562細胞中幾乎不表達HLA-Ⅰ，CD34+CD38-KG1a細胞高表達HLA-Ⅰ，CD34+CD38-KG1a細胞中HLA-Ⅰ的表達率顯著高于K562細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 K562和CD34+CD38-KG1a細胞表面NKG2D配體和HLA-Ⅰ分子的表達率

3 討論

LSC不僅凋亡相關基因發(fā)生改變，其免疫原性也發(fā)生了改變(尤其在和免疫系統(tǒng)進行對抗作用后)，如MHC抗原表達缺失或降低、黏附分子和共刺激分子表達下降、抗原加工提呈障礙、低表達NKG2D配體等，這些免疫原性改變使LSC能夠逃逸免疫細胞識別和殺傷，最終發(fā)展為白血病[5]。NK細胞是機體的細胞毒性淋巴細胞，在殺傷腫瘤細胞的過程中，無需特異性抗原提呈，可直接發(fā)揮殺傷作用，比其他免疫細胞更直接、更迅速，在抗腫瘤免疫中起重要作用，是近年來過繼性免疫治療的新星[6]。

NK細胞的殺傷活性由其表面的活化性受體、抑制性受體傳遞的信號共同決定。NKG2D是NK細胞表面的主要活化性受體，其配體為ULBP，目前發(fā)現(xiàn)的成員有 ULBP1、ULBP2、ULBP3和MICA/B[7]。KIR是NK細胞表面主要抑制性受體，和腫瘤細胞表面的HLA- I類分子結合后傳遞抑制性信號[8]。KIR分子不同，識別并結合的HLA-I分子也不同[9]，KIR2DL1識別HLA-Cw2、Cw4、Cw5和Cw6；KIR2DL2/2DL3識別HLA-Cw1、Cw3、Cw7和Cw8；KIR3DL1識別HLA-Bw4；KIR3DL2識別HLA-A3和A11；其余的KIR配體目前尚未完全明確[10]。NK細胞通過其表面2種受體與靶細胞表面配體相結合，傳遞不同信號，調節(jié)NK細胞的功能發(fā)揮。

本研究結果顯示，CD34+CD38-KG1a細胞明顯抵抗NK細胞的殺傷作用，即使在效靶比為20：1時，殺傷率仍小于15%，而K562細胞對NK細胞的殺傷作用高度敏感，在同一效靶比時NK細胞對K562細胞殺傷率顯著高于CD34+CD38-KG1a細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)，K562細胞幾乎不表達HLA-I分子，因此不能與NK細胞表面KIR受體結合傳遞抑制性信號，而活化性配體NKG2D高表達，導致殺傷信號明顯增強，故K562細胞對NK細胞殺傷作用高度敏感。而CD34+CD38-KG1a細胞高表達HLA-I類分子，能與NK細胞表面KIR受體結合，傳遞抑制性信號；其基因型為A30、30，B51、78，Cw4、16。HLA-Cw4能與NK細胞表面的KIR2DL1分子識別；因此，CD34+CD38-KG1a細胞能通過Cw4-KIR2DL1途徑向NK細胞傳遞抑制性信號。HLA-A30不能識別KIR3DL2和HLA-B51、78不能識別KIR3DL1、3DL2 配體，存在錯配，傳遞活化信號；但是其活化性配體NKG2D幾乎不表達，導致活化性信號較弱。2種信號作用NK細胞后抑制性信號占優(yōu)勢，導致CD34+CD38-KG1a細胞抵抗NK細胞的殺傷作用。

研究表明，NKG2D配體在白血病細胞中相對廣泛的表達使其在誘導NK細胞毒性反應中起著重要作用，NKG2D配體下調或丟失可導致LSC抵抗免疫細胞殺傷作用[11]。LSC逃逸免疫細胞殺傷作用的能力，一部分是其固有的，一部分是在與免疫細胞相互作用中獲得的[12]。因此，研究如何恢復或增強白血病細胞表面NKG2D配體的表達，或者干擾LSC的HLA基因或分子使之與KIR發(fā)生錯配，將會為提高白血病免疫治療效果提供一種新的思路。