肝細(xì)胞癌中microRNA-1469表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

王宇鋒，朱怡鳳，殷國志

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710061)

我國肝癌發(fā)病率較高，其中約90%為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1-2]。目前，HCC的診斷與治療水平已經(jīng)有了大幅提升，但HCC患者的整體預(yù)后仍然較差，手術(shù)仍是首選治療方式[1，3-6]。近年來，腫瘤靶向治療為HCC患者帶來了新的曙光，microRNA是研究較多且較為深入的一類靶點(diǎn)[7-14]。MicroRNA是一類長度18～25個(gè)核苷酸序列的非編碼單鏈小分子RNA，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后有密切關(guān)系[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-1469(miR-1469)與腫瘤密切相關(guān)，在食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為，且與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)[18-20]。目前，miR-1469在HCC中的表達(dá)及其對(duì)HCC細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲和遷移等的影響鮮有報(bào)道。本研究旨在探討miR-1469表達(dá)與HCC患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系及其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2010年1月至2012年12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的HCC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣>2 cm)標(biāo)本各76例，男66例，女10例，年齡30～75歲，中位年齡49歲。所有患者術(shù)前未接受放射治療、化學(xué)治療及其他輔助治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為HCC。HCC組織和癌旁組織經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋保存。所有患者術(shù)后隨訪36個(gè)月。本研究獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器人正常肝細(xì)胞(LO2)及肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清和達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-1469特異性引物、miRNA 內(nèi)參U6引物、miR-1469過表達(dá)類似物(miR-1469 mimics)、miR-1469過表達(dá)類似物的陰性對(duì)照均購自美國Gene Copoeia公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8、流式細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技股份有限公司，兔抗人NDRG1單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自美國Milipore公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96)、全自動(dòng)凝膠電泳分析系統(tǒng)(170-8265)購自美國Bio-rad公司，Transwell小室購自美國Corning公司，倒置相差顯微鏡購自上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司，流式細(xì)胞儀(FACSCanto II)購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HCC組織、癌旁組織以及LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細(xì)胞中miR-1469的表達(dá)應(yīng)用TRIzol提取RNA技術(shù)按照TRIzol試劑說明書步驟提取收集HCC組織、癌旁組織和LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細(xì)胞中的總RNA，當(dāng)RNA樣品的核酸在260 nm處的吸光度值與蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度值的比值在1.8～2.0時(shí)，樣品合格。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 4 μL，Reaction Mix(5×)1 μg，SuperScript Enzyme Mix(10×)2 μL，然后加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水補(bǔ)足至20 μL，混勻，離心。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，然后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。依照miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。20 μL反應(yīng)體系：EXPRESS SYBR Green ERTM qPCR Super Mix 10 μL，10 μmol·L-1miR-1469特異性引物或內(nèi)參U6引物0.4 μL，10 μmol·L-1通用qPCR引物0.4 μL，熒光定量PCR參比染料 0.04 μL，cDNA 2 μL，DEPC處理水7.16 μL，混勻，離心。每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)孵育2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。60 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后直接得到樣本的域值循環(huán)數(shù)，應(yīng)用2-△△CT法處理數(shù)據(jù)。小核RNA U6為內(nèi)參。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列：miR-1469上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGCTCGGCGCGGGGCGCG-3′，下游引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-CAATTCAGTTGAGGGAGCCCG-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染將Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的Hep3B或SMMC-7721細(xì)胞，胰蛋白酶消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，接種于6孔板(每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞)中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)將Hep3B細(xì)胞分為miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-1469 mimics和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細(xì)胞；將SMMC-7721細(xì)胞分為miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-1469 inhibitors(anti-miR-1469)和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至的miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞中miR-1469表達(dá)Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后應(yīng)用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測定其純度及濃度，確保RNA樣品的核酸在260 nm處的吸光度值與蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度值的比值在1.8～2.0，然后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，20 μL反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 1 μg，Reaction Mix(5×)4 μL，Super Script Enzyme Mix(10×)2 μL，然后加入DEPC水補(bǔ)足至20 μL，混勻，離心。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，然后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。依照miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。20 μL反應(yīng)體系：EXPRESS SYBR Green ERTM qPCR Super Mix 10 μL，10 μmol·L-1miR-1469特異性引物或內(nèi)參U6引物0.4 μL，10 μmol·L-1通用qPCR引物0.4 μL，熒光定量PCR參比染料 0.04 μL，cDNA 2 μL，DEPC處理水7.16 μL，混勻，離心。每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)孵育2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃ 退火延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。60 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后直接得到樣本的域值循環(huán)數(shù)，應(yīng)用2-△△CT法處理數(shù)據(jù)。小核RNA U6為內(nèi)參。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列：miR-1469上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGCTCGGCGCG-GGGCGCG-3′，下游引物序列為5′-CTCAACTGG-TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGCCCG-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力取各組轉(zhuǎn)染后48 h的Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板，每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)24、48、72 h每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取490 nm處各孔的吸光度值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞克隆能力取各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，經(jīng)消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后接種于6孔板中，每孔300個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，輕輕搖晃培養(yǎng)板使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)板置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)(約2周)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)小心沖洗3次，甲醇固定15 min；然后，應(yīng)用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色30 min，用流水緩慢漂洗去除染色液，自然風(fēng)干。觀察細(xì)胞克隆形成情況，50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落作為1個(gè)克隆，計(jì)算克隆形成數(shù)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞周期細(xì)胞周期檢測按照細(xì)胞周期試劑盒說明書步驟進(jìn)行。取各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌、離心、重懸，將細(xì)胞加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中固定、4 ℃過夜。次日，離心后去除乙醇，PBS洗滌、重懸，加入核糖核酸酶(終質(zhì)量濃度為100 mg·L-1)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL碘化丙啶(終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1)，4 ℃避光染色 30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，細(xì)胞周期擬合軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞的侵襲與遷移能力取各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，將細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108L-1，取100 μL接種于Transwell上室(侵襲實(shí)驗(yàn)的上室平鋪Matrigel膠，遷移實(shí)驗(yàn)的上室未鋪Matrigel膠)，下室加入700 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽拭掉上室內(nèi)殘留的細(xì)胞，40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×100)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.8 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞中NDRG1蛋白表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，0.01 mol·L-1PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液充分裂解，15 000 r·min-1離心15 min后取上清液，二奎啉甲酸法測定總蛋白濃度。電泳前將蛋白樣品按5：1比例加入6×上樣緩沖液，煮沸5 min后即用120 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳。4 ℃條件下23 V電壓濕轉(zhuǎn)12 h。50 g·L-1脫脂奶粉(三乙醇胺緩沖鹽水溶液溶解)室溫封閉 1 h 后加入1：1 000稀釋的NDRG1一抗及β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，含Tween-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液漂洗6次，每次5 min，加入二抗(按 1：10 000 稀釋)，室溫孵育1 h。Tween-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液漂洗6次，每次5 min。暗室內(nèi)浸入ECL液顯色，膠片曝光，洗片。利用ImageJ圖像分析軟件對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析，獲得細(xì)胞中NDRG1蛋白相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織和癌旁組織中miR-1469的表達(dá)miR-1469在HCC組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.71±0.03、5.49±0.04，HCC組織中miR-1469相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.640，P<0.05)。

2.2 MiR-1469表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。根據(jù)76例HCC組織中miR-1469的平均表達(dá)水平(0.71±0.03)，將高于平均表達(dá)水平的HCC患者納入miR-1469高表達(dá)組(n=33)，將低于平均表達(dá)水平的患者納入miR-1469低表達(dá)組(n=43)。miR-1469表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、TNM分期、組織分化程度及微血管侵犯相關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、性別、血清甲胎蛋白水平、靜脈侵犯、Edmondson病理分級(jí)、腫瘤部位無相關(guān)性(P>0.05)。

表1 MiR-1469表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 MiR-1469表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見圖1。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-1469高表達(dá)HCC患者的3 a總體生存率顯著高于低表達(dá)者(χ2=3.942，P<0.05)。

2.4 LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細(xì)胞中miR-1469表達(dá)miR-1469在LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.02、0.45±0.01、0.05±0.01、0.61±0.02、0.14±0.01、0.29±0.02；miR-1469在HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于LO2細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.370、38.490、12.320、31.650、24.840，P<0.05)；其中Hep3B細(xì)胞中miR-1469表達(dá)量最低，SMMC-7721細(xì)胞中miR-1469表達(dá)量最高。

2.5 轉(zhuǎn)染后Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞中miR-1469表達(dá)miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細(xì)胞中miR-1469相對(duì)表達(dá)量分別為4.47±0.15、0.05±0.01，miR-1469 mimics組Hep3B細(xì)胞中miR-1469相對(duì)表達(dá)量顯著高于miR-1469 control mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.320，P<0.05)。miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞中miR-1469相對(duì)表達(dá)量分別為0.20±0.11、1.00±0.00，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞中miR-1469相對(duì)表達(dá)量顯著低于miR-1469 control inhibitors組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.470，P<0.05)。

2.6 MiR-1469對(duì)Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞增殖及克隆能力的影響結(jié)果見表2、表3和圖2。培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，miR-1469 mimics組Hep3B細(xì)胞增殖能力顯著低于miR-1469 control mimics組，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力顯著高于miR-1469 control inhibitors組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細(xì)胞的克隆數(shù)分別為17.00±1.73、65.67±2.33，miR-1469 mimics組Hep3B細(xì)胞克隆形成能力顯著低于miR-1469 control mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.750，P<0.05)；miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞的克隆數(shù)分別為93.00±2.08、27.67±1.45，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞的克隆形成能力顯著高于miR-1469 control inhibitors組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.740，P<0.05)。

表2 過表達(dá)miR-1469對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖能力的影響

表3 下調(diào)miR-1469表達(dá)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響

A：miR-1469 control mimics組；B：miR-1469 mimics組；C：miR-1469 control inhibitors組；D：miR-1469 inhibitors組。

2.7 MiR-1469對(duì)Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表4和表5。與miR-1469 control mimics組比較，miR-1469 mimics組G1期Hep3B細(xì)胞顯著增多，S期Hep3B細(xì)胞顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.200、23.480，P<0.05)；但2組G2期細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.633，P>0.05)。與miR-1469 control inhibitors組比較，miR-1469 inhibitors組G1期SMMC-7721細(xì)胞顯著減少，S期SMMC-7721細(xì)胞顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.413、6.379，P<0.05)；但2組G2期SMMC-7721細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.214，P>0.05)。

表4 過表達(dá)miR-1469對(duì)Hep3B細(xì)胞周期的影響

表5 MiR-1469表達(dá)下調(diào)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響

2.8 MiR-1469對(duì)Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響結(jié)果見圖3。miR-1469 mimics組Hep3B細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別為59.00±2.08、29.00±2.08，miR-1469 control mimics組Hep3B細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別為35.00±1.53、20.33±1.45；miR-1469 mimics組Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著高于miR-1469 control mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.295、3.414，P<0.05)。miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別為26.00±1.16、17.33±0.88，miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)分別為56.33±3.18、44.67±1.45；miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著低于miR-1469 control inhibitors組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.966、16.080，P<0.05)。

2.9 miR-1469對(duì)Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞中NDRG1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4。miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細(xì)胞中NDRG1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.04、1.00±0.00，miR-1469 mimics組Hep3B細(xì)胞中NDRG1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于miR-1469 control mimics組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.760，P<0.05)；miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞中NDRG1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.90±0.17、1.00±0.00，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細(xì)胞中NDRG1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于miR-1469 control inhibitors組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.740，P<0.05)。

A：miR-1469 control mimics組；B：miR-1469 mimics組；C：miR-1469 control inhibitors組；D：miR-1469 inhibitors組。

1：miR-1469 control mimics組；2：miR-1469 mimics組；3：miR-1469 control inhibitors組；4：miR-1469 inhibitors組。

3 討論

HCC是原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型，是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和致死率，因此，提高HCC的診斷與治療水平具有重要意義[21-23]。近年來，以microRNA為代表的靶點(diǎn)是研究熱點(diǎn)之一[24-26]。MicroRNA主要通過與靶mRNA的3′端非編碼區(qū)域(3′-untranslated region，3′-UTR)互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[17]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的microRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1469在食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為，且與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)判斷腫瘤的惡性程度及患者預(yù)后具有一定的臨床參考價(jià)值[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，miR-1469在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)均顯著下調(diào)，且與腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、TNM分期、組織分化程度及微血管侵犯顯著相關(guān)，miR-1469低表達(dá)HCC患者的3 a總體生存率顯著低于高表達(dá)者；該結(jié)果提示，miR-1469可能是HCC的抑癌基因，對(duì)判斷HCC的惡性程度及患者預(yù)后具有一定的臨床參考價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)HCC細(xì)胞中miR-1469表達(dá)水平后，HCC細(xì)胞的活力、克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞侵襲、遷移能力均受到顯著抑制；而下調(diào)HCC細(xì)胞中miR-1469表達(dá)水平后，上述生物學(xué)功能明顯增強(qiáng)；該結(jié)果表明，miR-1469高表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，并抑制HCC細(xì)胞的侵襲、遷移能力；miR-1469為HCC的抑癌基因，可以通過抑制HCC細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、侵襲及遷移而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

為進(jìn)一步探究miR-1469的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(http：//www.microrna.org/microrna/home；http：//www.targetscan.org)預(yù)測miR-1469的下游靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)NDRG1是上述數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測的靶點(diǎn)之一。NDRG1的3′-UTR具有與miR-1469結(jié)合的區(qū)域，已證實(shí)NDRG1為HCC的促癌基因。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)Hep3B細(xì)胞中的miR-1469后，NDRG1的表達(dá)水平明顯下調(diào)；而抑制SMMC-7721細(xì)胞中的miR-1469的表達(dá)后，NDRG1的表達(dá)水平顯著上調(diào)；該結(jié)果提示，HCC細(xì)胞中的NDRG1可能為miR-1469的作用靶點(diǎn)。有研究表明，HCC細(xì)胞中過表達(dá)的NDRG1能夠競爭性結(jié)合GSK-3β和Nur77，從而減少β-catenin的降解，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin通路[27]。筆者推測，HCC細(xì)胞中miR-1469能夠通過靶向結(jié)合并降低NDRG1表達(dá)，從而促進(jìn)β-catenin的降解，抑制Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而抑制HCC進(jìn)展；但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-1469在HCC中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、TNM分期、組織分化程度、微血管侵犯及患者預(yù)后密切相關(guān)；miR-1469可以通過靶向結(jié)合NDRG1并抑制其表達(dá)從而抑制HCC細(xì)胞的增殖、周期、侵襲和遷移。本研究為進(jìn)一步了解HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及尋找新的分子治療靶點(diǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。