大黃素增強(qiáng)索拉菲尼抗肝癌治療作用的機(jī)制研究

王清清 張浩 曹浩強(qiáng) 俞清江

大黃素（Emodin,Emo）是從大黃、何首烏、虎杖等中藥中提取出的一種蒽醌類單體化合物，具有抗癌（包括肝癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤）的藥理學(xué)作用，同時(shí)對(duì)肝、腎有保護(hù)作用[1]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過(guò)程，也是腫瘤耐藥機(jī)制之一[2]。在先前的研究中本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)肝癌索拉菲尼（sorafenib,Sora）耐藥細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性及遷移和轉(zhuǎn)移能力[3]，本研究將進(jìn)一步探討Emo是否能增強(qiáng)Sora抑制人肝癌Sora耐藥細(xì)胞的活性和遷移能力及其機(jī)制，為提高Sora抗肝癌治療的臨床療效提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7均購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；Emo（批號(hào)：PRF8021741，純度≥98%）購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；Sora購(gòu)自德國(guó)Bayer公司；FBS購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK8法）試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Laboratories公司；Western blot實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)Bio-Rad電泳儀，試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；一抗兔抗人N-cadherin、Vimenti、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Teclnology公司；二抗兔抗羊購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Syngene公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與肝癌Sora耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建 將人肝癌親本細(xì)胞株Huh7和HepG2置于含10%FBS的高糖培養(yǎng)基（DMEM）中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)操作；Huh7R和HepG2R是經(jīng)體外2μM的Sora低濃度開始誘導(dǎo)，持續(xù)1~2個(gè)月，逐步增加Sora藥物處理濃度，直至達(dá)到細(xì)胞的最大藥物耐受濃度所制成的耐藥細(xì)胞，總誘導(dǎo)周期約6個(gè)月。

1.3 肝癌Sora耐藥細(xì)胞的分組 根據(jù)處理因素的不同將兩種肝癌Sora耐藥細(xì)胞株分別分為對(duì)照組、Sora組、Emo組、Sora+Emo組，對(duì)照組不加入任何藥物，Sora組加入濃度為2μM的Sora，Emo組分別加入濃度為25、30μM 的 Emo，Sora+Emo 組分別加入 2μM Sora、25μM Emo及 2μM Sora、30μM Emo。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK8法。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞，胰酶消化后用含5%FBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（5×104/ml）后接種到96孔培養(yǎng)板中孵育過(guò)夜，丟棄舊培養(yǎng)液。先檢測(cè)Sora半數(shù)抑制濃度（IC50）：Huh7、HepG2 和 Huh7R、HepG2R 細(xì)胞中加入不同濃度的 Sora（0、1、2、4、6、8、10、12μM），根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果，應(yīng)用GraphPad Prism5軟件計(jì)算各組對(duì)Sora的IC50；再將在含5%FBS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48h的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞除去培養(yǎng)液，每孔加入CCK8試劑與DMEM 1∶9混合液 100μl，置于 37℃孵箱中繼續(xù)孵育 1~2h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定液體的吸光度（A）值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活率（%）=[實(shí)驗(yàn)組（OD）-空白組（OD）]/[對(duì)照組（OD）-空白組（OD）]×100%。

1.5 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè) 采用集落形成實(shí)驗(yàn)。將人肝癌Sora耐藥細(xì)胞按照300個(gè)/孔的濃度接種到6孔板中。24h后，Sora組、Emo組、Sora+Emo組用含不同濃度藥物的10%FBS培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)10d。當(dāng)細(xì)胞集落形成肉眼可見的克隆時(shí)，終止實(shí)驗(yàn)，丟棄舊培養(yǎng)液，甲醇固定20min，0.01%結(jié)晶紫染色20min，用相機(jī)拍照后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2R和Huh7R細(xì)胞，用胰酶消化后用PBS清洗3次，用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；取 200μl細(xì)胞懸液（5×104個(gè)細(xì)胞/100μl）鋪于小室上層，下室加入含不同濃度藥物的20%FBS培養(yǎng)液；48h后取出Transwll小室，棄去小室中的培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS清洗3遍后用預(yù)冷的甲醇固定20min，0.01%結(jié)晶紫染色20min；PBS清洗小室，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野（×200），計(jì)數(shù)穿膜遷移的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 EMT相關(guān)蛋白N-cadherin和Vimenti表達(dá)檢測(cè)采用Western blot法，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)藥物處理48h后，用預(yù)冷的PBS清洗3次，加入預(yù)先配制好的蛋白裂解混合液（RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑=100∶1）在冰上裂解30min；收集的細(xì)胞裂解液于4℃、12 000g/min離心15min，按照BCA定量說(shuō)明書對(duì)上清液定量；加入5×loading buffer上樣緩沖液，于100℃蛋白煮沸變10min；每實(shí)驗(yàn)組加入20~30μg蛋白，選擇10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠）電泳，在100V電壓及100min的濕轉(zhuǎn)條件下將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜（硝酸纖維素膜）上，然后用含5%脫脂奶粉的封閉液于室溫下孵育2h；加入相應(yīng)的一抗稀釋液（1∶1 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜，PBST緩沖液漂洗3次×15min，二抗稀釋液（1∶1 000）室溫孵育 2h，PBST 漂洗 3 次×15min；ECL發(fā)光液顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖片，ImageJ軟件分析灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌親本細(xì)胞和Sora耐藥細(xì)胞的IC50比較 Huh7的 IC50為 3.8±0.4，HepG2 為 3.5±0.3，Huh7R 為 5.6±0.8，HepG2R為9.0±1.1。HepG2R和Huh7R的IC50均明顯高于HepG2和Huh7，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞存活率比較 Sora+Emo組的細(xì)胞存活率均明顯低于對(duì)照組、Sora組及Emo組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1。

2.3 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的克隆形成數(shù)目比較 Sora+Emo組的克隆形成個(gè)數(shù)明顯低于對(duì)照組、Sora組及Emo組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖 1、表 2。

表1 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的存活率比較（%）

2.4 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的遷移數(shù)目比較 Sora+Emo組的細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)明顯低于對(duì)照組、Sora組及Emo組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖 2（見插頁(yè)）、表 3。

圖1 Emo和Sora抑制肝癌Sora耐藥細(xì)胞的克隆形成

表2 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的克隆形成數(shù)目比較（個(gè)）

2.5 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 Sora+Emo組的間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimenti蛋白表達(dá)下降，相對(duì)蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組、Sora組及Emo組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見圖 3、表 4。

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居全球第2位[4]。手術(shù)切除是治療早期肝癌的首選方法，但是往往很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，失去了根治性切除的機(jī)會(huì)。Sora是唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療晚期肝癌的一線分子靶向藥物，能有效抑制RAF/MEK/ERK介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路而直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，還可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）受體而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是只能夠延長(zhǎng)患者3個(gè)月的生存期[5]。一些學(xué)者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的Sora刺激可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[3，9]?？梢奡ora的長(zhǎng)期應(yīng)用容易產(chǎn)生獲得性耐藥，限制了其臨床療效。因此，探索肝癌Sora耐藥機(jī)制已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

表3 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的遷移數(shù)目比較（個(gè)）

圖3 Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的蛋白電泳圖

表4 不同濃度Emo和Sora處理后肝癌Sora耐藥細(xì)胞的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Emo是中藥大黃的有效成分之一，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)基因來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Kim等[6]的研究提出Emo能夠通過(guò)抑制膽固醇代謝來(lái)增強(qiáng)Sora對(duì)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性，同時(shí)也有學(xué)者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究提出Emo不僅能夠抑制肝癌的生長(zhǎng)，而且對(duì)小鼠肝、腎功能無(wú)明顯影響，預(yù)示著Emo是一種的安全、有效的藥物[7]。因此，目前研究認(rèn)為Emo能作為腫瘤聯(lián)合化療的輔助用藥。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，EMT是腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的分子機(jī)制之一，其特點(diǎn)表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去基底側(cè)極性和細(xì)胞間的黏附力，間葉細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)過(guò)程，被認(rèn)為與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。van Malenstein等[9]研究提出肝癌Sora耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT，而且具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在本研究團(tuán)隊(duì)先前的實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)肝癌Sora耐藥模型發(fā)生EMT[3]。同時(shí)，一些學(xué)者提出腫瘤細(xì)胞的EMT對(duì)細(xì)胞毒性藥物和分子靶向藥物的耐藥性起著關(guān)鍵作用，其中包括肝癌Sora耐藥[10-11]；因此，靶向EMT為研究切入點(diǎn)，是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥、提高臨床療效的新型研究方向。本研究通過(guò)長(zhǎng)期低濃度Sora誘導(dǎo)成功構(gòu)建人肝癌Sora耐藥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)Emo聯(lián)合低濃度Sora能夠有效抑制其增殖及克隆形成，較單一藥物處理具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性；同時(shí)，Emo聯(lián)合低濃度Sora作用人肝癌Sora耐藥細(xì)胞，與單一藥物處理組相比，細(xì)胞遷移數(shù)明顯下降，提示聯(lián)合用藥能顯著抑制耐藥細(xì)胞的遷移。通過(guò)深入研究顯示，聯(lián)合用藥能夠明顯抑制上皮標(biāo)記蛋白N-cadherin、Vimenti的表達(dá)，證實(shí)Emo聯(lián)合低濃度Sora對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制、遷移抑制與EMT相關(guān)。

當(dāng)然，本研究也有一定局限性，沒有構(gòu)建相對(duì)應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停菑哪壳暗难芯恐斜狙芯繄F(tuán)隊(duì)總結(jié)如下：（1）Emo聯(lián)合低濃度Sora能夠增強(qiáng)Sora的藥物敏感性，增強(qiáng)其抗腫瘤活性；（2）Emo聯(lián)合低濃度Sora能夠抑制耐藥細(xì)胞的遷移；（3）Emo可能通過(guò)抑制EMT來(lái)影響其生物學(xué)行為。