血必凈對兔急性肺損傷的早期保護作用及其機制研究

賀慧博 郝建 楊煒

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory disease syndrome，ARDS）是同一疾病過程的兩個階段，是指由各種肺內(nèi)、肺外因素導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷和進而發(fā)展的急性呼吸衰竭，是臨床常見危重癥，病死率高達30%~50%[1]。ALI的發(fā)病本質(zhì)是各種肺內(nèi)、肺外致病因素引起肺部炎癥細胞（中性粒細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等）反應(yīng)，大量炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1等）在肺中激活、聚集，異常升高的細胞因子與過度激活的免疫細胞、中性粒細胞、巨噬細胞之間形成正反饋機制，最終造成肺組織中炎癥反應(yīng)失控，肺毛細血管內(nèi)皮細胞以及肺泡上皮細胞彌漫性損傷，大量滲出液聚集使氣道阻塞，臨床表現(xiàn)為急性非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥（PaO2/FiO2≤300mmHg）[2-3]。爆炸傷是 ALI的常見致病因素，無論是戰(zhàn)爭，還是生活、生產(chǎn)過程中，爆炸事故頻發(fā)。爆炸產(chǎn)生的沖擊波、高溫、有毒有害氣體等因素極易造成肺實質(zhì)、肺間質(zhì)的損傷，進而引起多種炎癥細胞的反應(yīng)、炎性介質(zhì)釋放、血管通透性改變等，最終造成ALI。目前爆炸制備家兔急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ头椒ǔ墒?，且能很好?fù)制ALI狀態(tài)[4-5]。血必凈是紅花、丹參、赤芍、當(dāng)歸、川芎等提取物制成的中藥復(fù)合制劑，主要成分是紅花黃色素A，臨床主要用于因感染、燒傷、創(chuàng)傷等引起的局部或全身炎癥反應(yīng)及多器官功能衰竭綜合征的早期治療。研究表明，血必凈能夠有效地拮抗內(nèi)毒素、抑制TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8 等內(nèi)源性炎性介質(zhì)的過度釋放，增強機體免疫，改善微循環(huán)等[6]。本研究通過爆炸制備家兔急性肺損傷模型，探討血必凈對抑制ALI早期急性炎癥反應(yīng)的作用機制，為臨床ALI的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物、試劑與儀器 血必凈注射液（10ml/支）購自天津紅日藥業(yè)；地塞米松磷酸鈉注射液（5mg/支）購自山西晉新雙鶴藥業(yè)；ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB Western blot試劑盒（148G3026）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）Western blot試劑盒（217K2185）均購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（00145205）購自美國Thermo公司；ActinTA-09（150527）、山羊抗小鼠IgG ZB2305（109145）、山羊抗兔IgG ZB2301（109525）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；引物合成設(shè)備及Trizol（14105）購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗動物 普通清潔級家兔40只，雌雄各半，體重（2.25±0.25）kg，購于安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司，合格證號 scxk（皖）2006-002。

1.3 方法

1.3.1 分組 將40只家兔按隨機數(shù)字表法分為血必凈低劑量（L）組、高劑量（H）組、地塞米松（D）組、氯化鈉注射液對照（N）組及ALI模型（A）組5組，每組8只。除了N組外其他組均進行ALI模型制備，造模成功后L、H組分別給予10、20ml/kg的血必凈注射液；D組給予0.5ml/kg地塞米松注射液（1mg/ml）；N、A組給予10ml/kg氯化鈉注射液。各組于實驗前禁食12h，禁水4h。

1.3.2 ALI模型制備 依據(jù)相關(guān)文獻，采用空中爆炸法制備ALI模型[4-5]。將家兔胸部脫毛，雙耳備皮、塞入棉球，固定于支架，置于鋼質(zhì)保護箱（保護箱于家兔胸部位置有一開口，大小可調(diào)，控制實驗時暴露部分僅為家兔胸部，其余身體部位均在箱體內(nèi)）。將鋼制保護箱放置于空中爆炸場并固定。爆炸裝置為35g球形工業(yè)炸藥，藥心與家兔胸部中心點同一水平，水平距離35cm，引爆裝置為8號雷管。在距離炸藥藥心水平線35cm的另一側(cè)安置空中壓力傳感器，用于監(jiān)測點處壓力時程曲線，爆炸程序由專業(yè)人員操作。爆炸后，立即對爆炸場內(nèi)抽風(fēng)排氣，迅速轉(zhuǎn)移實驗樣本于安全通風(fēng)環(huán)境下，進行簡單處理（清創(chuàng)縫合傷口，保持呼吸道通暢等），觀察并記錄其生命體征。造模成功后，各組家兔給予相應(yīng)藥物處理，24h后，家兔麻醉、抽血、取材。本研究中涉及家兔相關(guān)處置均通過安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準。

1.3.3 檢測指標(biāo)

1.3.3.1 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量測定 采用ELISA法。取家兔耳緣靜脈血，常溫3 000r/min離心10min，取上清液于-80℃液氮罐保存。ELISA法檢測按說明書操作。

1.3.3.2 肺濕干重比（W/D） 麻醉后取右肺中葉肺組織2.5g左右，吸干表面雜質(zhì)，稱取濕重后，再置于80℃烘箱72h至烘干，稱取干重，計算比值。

1.3.3.3 肺組織NF-κB、MMP-9蛋白表達水平測定 采用Western blot法。麻醉后取右肺上葉部分肺組織100mg左右，稱重，剪碎，液氮研磨，加入RIPA細胞裂解液1ml，12 000r/min離心10min，取上清液，即含有組織總蛋白，采用Western blot法進行測定，相關(guān)方法步驟嚴格參照說明書進行。

1.3.3.4 肺組織NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平測定采用RT-PCR法。取右肺上葉肺組織樣本，稱重，剪碎，液氮研磨，加入1ml Trizol勻漿于4℃、12 000r/min離心10min。采用Trizol法獲取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再行熒光定量PCR反應(yīng)。實驗采用相對定量研究法法進行分析，分析采取的指標(biāo)為：2-ΔΔCt。實驗使用的上游引物序列為：5′-TGGTCAGCTCCCTTCTCTGT-3′，下游引物為：5′-TACCTCCAGCCTGCTTCTGT-3′。相關(guān)方法步驟嚴格參照說明書進行。

1.3.3.5 肺組織病理學(xué)觀察 肺組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片4~5μm厚，HE染色，光鏡下觀察其病理改變。并采用Smith肺損傷病理評分[7]進行評價：沒有損傷為0分；輕度損傷、間質(zhì)水腫和局限性壞死、病變范圍＜25%為1分；中度損傷、廣泛的肺臟細胞腫脹和壞死、或病變范圍25%～50%為2分；嚴重損傷、有毛細血管內(nèi)皮腫脹、細胞間隙增寬、大量炎性細胞浸潤和肺臟萎縮的壞死，或病變范圍51%～75%為3分；極嚴重的損傷、彌漫性血管損傷、出血和肺臟壞死，或病變范圍76%～100%為4分。累加每組家兔的分數(shù)，并計算出平均分值，分值越高提示該組家兔炎癥病變程度越重。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組家兔血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量及肺 W/D 值比較 L、H、D、A 組 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及W/D值均比N組高（均P＜0.05）；L、H、D組TNF-α、IL-1β、IL-6及W/D值均比A組低，其中H組降低最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而L、H 、D組IL-10含量均高于A組，其中H組升高明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 1。

2.2 5組家兔肺組織NF-κB、MMP-9蛋白表達水平比較 肺組織NF-κB、MMP-9蛋白表達水平以A組最高，而L、D、H組依次降低，H組降低最顯著，見圖1。

2.3 5組家兔肺組織NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平的比較 L、H、D、A 組 NF-κB、MMP-9 mRNA 的表達水平均比N組高（均P＜0.05），L、H、D組則均比A組低，其中以H組降低最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 2、表 2。

2.4 5組家兔肺組織病理變化 N組未見明顯改變，其余各組肉眼可見肺體積變大，表面散在瘀斑，部分組織切面可見紅色實樣變，伴有泡沫樣滲出。光鏡下見肺泡壁充血，間質(zhì)水腫，肺泡腔相對狹窄，伴炎癥細胞浸潤，可見出血、滲出等。L、H、D組較A組改變相對較輕，其炎性浸潤等較少、且肺泡壁充血相對改善，其中以H組改善最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3、圖3。

3 討論

實驗前，各組家兔呼吸、心率等生命體征均平穩(wěn)，無煩躁不安、意識異常等情況。爆炸致傷后，各組家兔呼吸淺快，活動后出現(xiàn)呼吸窘迫、點頭呼吸等現(xiàn)象，口唇等皮膚黏膜相繼出現(xiàn)發(fā)紺，口鼻分泌物增多，肺部聽診有明顯濕啰音，甚至少數(shù)家兔出現(xiàn)短暫昏迷，提示出現(xiàn)呼吸功能不全。爆炸致傷后，肉眼可見家兔肺體積變大，表面散在瘀斑，部分組織切面可見紅色實樣變，切面可伴有泡沫樣滲出。光鏡下見肺泡壁充血，間質(zhì)水腫，肺泡腔相對狹窄，伴炎癥細胞浸潤，可見出血、滲出等。爆炸損傷肺實質(zhì)、肺間質(zhì)，引起多種炎癥細胞的反應(yīng)、炎性介質(zhì)釋放、血管通透性改變，肺順應(yīng)性改變等，進而引起肺通氣血流比例失調(diào)，出現(xiàn)呼吸困難等現(xiàn)象。L、D、H、A組均出現(xiàn)以上現(xiàn)象，但以H組改變相對最輕。本實驗顯示，爆炸后各組家兔呼吸加快、呼吸困難、煩躁不安，口鼻分泌物增多，昏迷，肺部啰音等，W/D比值明顯升高，血氣PaO2/FiO2≤300mmHg，且肺病理學(xué)改變符合ALI病理變化標(biāo)準，提示造模成功、有效[8]。

ALI發(fā)病機制復(fù)雜，肺或全身炎癥反應(yīng)失控被認為是ALI/ARDS的主要發(fā)病機制。爆炸傷后，炎癥介質(zhì)尤其是TNF-α、IL-1、IL-6等“早期反應(yīng)細胞因子”大量釋放，從而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。其中促炎細胞因子（主要包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等）和抗炎細胞因子（主要有IL-4、IL-10、IL-1受體拮抗劑等）失衡在發(fā)病過程中起重要作用[9]。IL-1β在ALI發(fā)病中能誘導(dǎo)中性粒細胞和單核/巨噬細胞趨化，產(chǎn)生多種趨化因子如IL-8、MCP-1等，最終導(dǎo)致炎癥浸潤。而TNF-α能誘導(dǎo)白細胞遷移、粒細胞脫顆粒、肺內(nèi)皮細胞活化、和毛細血管滲透性增加，促進水腫液形成，影響肺泡氣體交換，造成低氧血癥等；此外，TNF-α還與其他細胞因子形成作用網(wǎng)絡(luò)促進ALI的發(fā)生、發(fā)展[10]。而IL-10是一個以免疫抑制為主的多向免疫調(diào)節(jié)因子，其主要生物活性表現(xiàn)為直接抑制炎癥細胞活化，可抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF 等表達[11]。實驗結(jié)果顯示，造模成功后，L、H、D、A組血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達均比 N 組高；A組TNF-α、IL-1β、IL-6表達均高于 L、D、H 組；而 A 組IL-10的表達低于L、D、H組；其中均以H組變化最明顯。提示TNF-α、IL-1β、IL-6是ALI重要的促炎介質(zhì)，而IL-10在體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗炎作用，且血必凈、地塞米松對肺損傷都有保護作用，但以H組最明顯。

表1 5組家兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量及肺W/D值比較

圖1 5組家兔NF-κB、MMP-9蛋白表達電泳圖

圖 2 5組家兔 NF-κB、MMP-9 mRNA 的擴增、熔解曲線（a：NF-κB mRNA 的擴增曲線；b：NF-κB mRNA 的熔解曲線；c：MMP-9 mRNA的擴增曲線；d:MMP-9 mRNA的熔解曲線）

表2 5組家兔肺組織NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平的比較

表3 5組家兔肺組織病理評分（分）

圖3 5組家兔組織病理學(xué)結(jié)果（a:N組；b:A組；c:L組；d:D組；e:H組；HE染色，×400）

NF-κB是參與調(diào)控機體多種免疫、炎癥反應(yīng)和應(yīng)激的早期快反應(yīng)基因表達的一種核蛋白因子。爆炸致傷家兔后，激活NF-κB，核易位增加，啟動TNF-α等表達，釋放的TNF-α等與創(chuàng)傷一起進一步易化NF-κB的活化[12]，基于以上觀點NF-κB可能是失控炎癥基因表達的調(diào)控點。本實驗結(jié)果顯示，造模后L、D、H組較A組NF-κB表達量降低，以H組變化最明顯。因此推測血必凈可能有抑制NF-κB表達、減輕炎癥反應(yīng)的作用。MMP-9是MMPs家族中的一員，研究表明，MMP-9在正常肺組織細胞中只產(chǎn)生極微量的MMP-9，一旦發(fā)生ALI，MMP-9表達量急劇上升[13]。且MMP-9與肺損傷程度正相關(guān)[14]。且MMP-9對多種促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等）發(fā)揮正反饋作用。因此有學(xué)者指出MMP-9是影響ALI發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一，抑制MMP-9的表達活性有望成為救治ALI的新途徑。本實驗結(jié)果同樣提示，造模后L、D、H組MMP-9表達量均較A組有不同程度降低，且降低程度與病理改變趨勢基本一致，且以H組變化最顯著，與相關(guān)研究結(jié)果類似，即MMP-9可以一定程度提示肺損傷程度。

血必凈是紅花、丹參、赤芍、當(dāng)歸、川芎等提取物制成的中藥復(fù)合制劑，主要有效成分為紅花黃色素A等物質(zhì)。研究表明血必凈注射液對創(chuàng)傷、感染等導(dǎo)致的ALI模型有較好的功效，能有效拮抗內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的作用，抑制炎癥因子的產(chǎn)生及作用[6，15]。臨床主要用于因感染、燒傷、創(chuàng)傷等引起的局部或全身炎癥反應(yīng)及引起的多器官功能衰竭綜合征的早期治療。本次實驗結(jié)果顯示，ALI模型，L、D、H、A 組 MMP-9、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達量及W/D均比N組高。經(jīng)血必凈治療后，L、H 組 MMP-9、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 表達量及W/D均比A組低，IL-10表達量則均比A組高，其中均以H組改變最顯著。且肺病理切片顯示血必凈治療后肺組織損傷明顯減輕。提示血必凈注射液可以通過下調(diào) MMP-9、NF-κB 的激活，抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6活性，增強IL-10活性，從而抑制炎癥反應(yīng)，抑制細胞早期急性炎癥反應(yīng)，阻斷細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，從而起到對家兔ALI的保護作用。

綜上所述，爆炸致傷家兔可以成功復(fù)制ALI模型。血必凈注射液可以通過下調(diào)MMP-9、NF-κB的激活，抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6 活性，增強 IL-10 活性，抑制細胞早期急性炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其對爆炸致家兔ALI的保護作用。