克隆猴：我國在非人靈長類研究領(lǐng)域由國際“并跑”到“領(lǐng)跑”

孫強(qiáng)　宋杰

體細(xì)胞克隆猴“中中”“華華” 日常生活狀態(tài)中科院腦智卓越中心 供圖

精子和卵子各攜帶一半遺傳物質(zhì)，相互結(jié)合在一起，形成受精卵并發(fā)育成一個新的個體，這是大家熟知的哺乳動物生殖方式，但體細(xì)胞克隆卻用“貍貓換太子”的手法，將一個體細(xì)胞里的染色體（即DNA）替換掉卵細(xì)胞中的DNA，再讓這個卵細(xì)胞用體細(xì)胞里的DNA完成新個體的孕育，其難度不言而喻。

自從1997年“多莉羊”體細(xì)胞克隆成功后，已有超過20種哺乳動物的克隆由全球多個生物醫(yī)學(xué)機(jī)構(gòu)相繼實(shí)現(xiàn)。其中，實(shí)驗(yàn)小鼠是生命科學(xué)研究與新藥研發(fā)最重要的模式動物之一，為科學(xué)家發(fā)現(xiàn)生命奧秘、幫助人類研發(fā)新藥，立下了赫赫功勛。

不過，真正讓全世界頂尖科研團(tuán)隊(duì)緊緊盯住的目標(biāo)始終只有一個——猴。因?yàn)殪`長類的進(jìn)化跟人類非常接近，對認(rèn)識人類的大腦、腦認(rèn)知功能和腦疾病有非常大的潛在應(yīng)用價值。

21世紀(jì)初，美國匹茲堡大學(xué)的科研人員在《科學(xué)》上發(fā)文稱，用體細(xì)胞克隆非人靈長類動物的理想是不可能實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)時，俄勒岡大學(xué)教授米塔利波夫撰文指出，科學(xué)家更應(yīng)該從人跡罕至的科學(xué)道路上發(fā)現(xiàn)不尋常的風(fēng)景。但在2011年，他在嘗試了15000枚猴卵細(xì)胞后失敗了：他制備的克隆猴在懷孕81天后流產(chǎn)。而這已是在這個領(lǐng)域取得的最好成績。

中國科學(xué)家能不能有所突破？能！中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）孫強(qiáng)研究員率領(lǐng)以博士后劉真為主的團(tuán)隊(duì)，經(jīng)過5年的不懈努力，終于在國際上首次實(shí)現(xiàn)了非人靈長類動物的體細(xì)胞克隆。

2017年11月27日，世界上首個體細(xì)胞克隆猴“中中”在中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）的非人靈長類平臺誕生;12月5日第二個克隆猴“華華”誕生。該成果標(biāo)志中國率先開啟了以體細(xì)胞克隆猴作為實(shí)驗(yàn)動物模型的新時代，實(shí)現(xiàn)了我國在非人靈長類研究領(lǐng)域由國際“并跑”到“領(lǐng)跑”的轉(zhuǎn)變。

那么，這個里程碑式的轉(zhuǎn)變背后有什么故事？本文系中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心非人靈長類研究平臺主任孫強(qiáng)作為親歷者對我國在體細(xì)胞克隆猴從孕育到誕生全過程的回顧，并授權(quán)《中國經(jīng)濟(jì)周刊》刊發(fā)。

零起點(diǎn)遇伯樂

2001年，國外有了轉(zhuǎn)基因猴，當(dāng)時中國不僅沒有轉(zhuǎn)基因猴，連試管猴也未見報道，而國外早在1984年就有了試管猴。

為了做出轉(zhuǎn)基因猴，我在博士畢業(yè)后，沒有選擇去國外做博士后，而是在2004年去了西雙版納的一座山上的養(yǎng)殖場開展猴生殖生理和轉(zhuǎn)基因猴構(gòu)建的研究。這個決定對于我來說并不容易，當(dāng)時妻子孩子都在揚(yáng)州，我兩個月才回一次家。盡管每次上山都要坐纜車，一周下山一次去買菜，我卻在這里待了將近4年。

經(jīng)過近4年的努力，雖然掌握了非人靈長類輔助生殖技術(shù)并得到了試管猴，但卻沒能得到轉(zhuǎn)基因猴。隨著原單位研究項(xiàng)目的結(jié)題，我繼續(xù)開展非人靈長類相關(guān)研究的科研條件也將失去。盡管我心里還一直惦記著自己熱愛并全身心投入的研究領(lǐng)域，但現(xiàn)實(shí)的困境逼迫我不得不考慮轉(zhuǎn)變科研方向。

幸運(yùn)的是，2009年，恰逢中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所制定發(fā)展“路線圖”的階段性目標(biāo)，計劃開辟能夠引領(lǐng)學(xué)科發(fā)展的、增強(qiáng)國際科技競爭力的、有應(yīng)用價值的非人靈長類研究領(lǐng)域，神經(jīng)所蒲慕明院士感受到了我內(nèi)心從事非人靈長類研究的強(qiáng)烈科研欲望，決定把建設(shè)非人靈長類研究平臺的重任交給我，我所熱愛的科研事業(yè)迎來了夢想中的春天。

體細(xì)胞克隆猴團(tuán)隊(duì)主要成員：蒲慕明（中）、孫強(qiáng)（左）、劉真（右） 中科院腦智卓越中心 供圖

上孤島建猴場

來到神經(jīng)所后，考慮到從頭建設(shè)非人靈長類設(shè)施需要花費(fèi)數(shù)年時間，我又一次選擇在一個遠(yuǎn)離家鄉(xiāng)和核心城市，在位于太湖中一個小島上的猴場，通過租用設(shè)施來實(shí)現(xiàn)盡快起步。

在島上最初的交通工具是自行車和電瓶車，這方便我們?nèi)ユ?zhèn)上收取試劑和耗材等快遞包裹。如果我們要出島，主要坐69路公交，距離市區(qū)較遠(yuǎn)，我們需要坐60站路大約2小時的車程才能到火車站。

早期島上沒有食堂，吃飯也是需要解決的問題，我們給每個宿舍都配備了廚房，大家輪流買菜做飯，到了節(jié)假日的時候還會組織一些集體聚餐，讓大家展示自己的廚藝，這樣既解決生活上的問題，又增進(jìn)了同事之間的感情。在生活上，我們就像一家人;在工作中，實(shí)驗(yàn)室就是我們的家。由于比較潮濕，實(shí)驗(yàn)室一樓的墻壁發(fā)黃甚至發(fā)霉，員工就自發(fā)組織起來，利用空閑時間粉刷墻壁和天花板，美化家園。

2010年國慶假期的一個雨夜，在從基地返回宿舍沒有路燈的路上騎行時，我摔斷了鎖骨。但當(dāng)時正是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，且還沒有培養(yǎng)出能夠替代我的人，我只好懸著胳膊繼續(xù)干了一個星期。實(shí)驗(yàn)做完再去醫(yī)治的時候，醫(yī)生發(fā)現(xiàn)摔斷的鎖骨已錯位，不得不重新切斷后再接上。

這樣的付出是值得的，2011年，我們成功得到了世界上首批攜帶人類自閉癥基因的猴模型;其后我們成功開發(fā)了實(shí)驗(yàn)猴成熟加速技術(shù)，將食蟹猴的繁殖周期從5年以上縮短到2.5年;我們還建立了基于分子核酸酶的基因編輯猴模型構(gòu)建技術(shù)，這些工作對整個中國非人靈長類研究起到了推動作用。

但是，上述方法構(gòu)建的模型猴仍然存在首建動物嵌合、脫靶和遺傳背景不均一等問題。2012年我毅然接下了攻克非人靈長類體細(xì)胞克隆技術(shù)這一重任，試圖解決這些問題。

試錯5年“步步為營”

20多年來，國際上多個頂級實(shí)驗(yàn)室都鎩羽而歸。世界公認(rèn)的克隆專家米塔利波夫前后用了1.5萬枚猴卵，卻仍以失敗告終。國際上一度悲觀地認(rèn)為體細(xì)胞克隆猴不可能成功。盡管如此，我和我的團(tuán)隊(duì)還是冒著很可能失敗或很長時間沒有成果的風(fēng)險，開始了體細(xì)胞克隆技術(shù)的攻關(guān)。

但我必須在前人失敗的基礎(chǔ)上思考如何攻關(guān)。體細(xì)胞克隆猴實(shí)驗(yàn)做了5年，我的團(tuán)隊(duì)也失敗了5年。深深的挫敗感時常使大家感到非常痛苦和沮喪。我也經(jīng)常勉勵大家，做最壞的打算，盡最大的努力。

在體細(xì)胞克隆猴技術(shù)具體操作上，主要有兩大難點(diǎn)。第一是拿掉細(xì)胞核的時候不能抽掉周圍太多營養(yǎng)物質(zhì)，否則細(xì)胞就會停止發(fā)育。此外，移植到卵細(xì)胞中的是成熟的、只表達(dá)某些特定基因的體細(xì)胞細(xì)胞核，研究人員需要想辦法讓它重新變成一個未分化的全能胚胎細(xì)胞。

由于猴子細(xì)胞不透明，在顯微鏡下看不到細(xì)胞核，需要通過偏振光才能把細(xì)胞核顯示出來。我們的研究人員注視著顯微鏡，在一閃一閃的偏振光下，操縱直徑10微米左右的極細(xì)針頭在細(xì)胞里吸取、注射，并盡可能減小對細(xì)胞的損傷，其難度遠(yuǎn)大于操縱繡花針。最終，我們的團(tuán)隊(duì)成員可以做到15秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞注入操作，只有精湛的技術(shù)才可以保證對卵細(xì)胞損傷最小。

而在核基因組啟動前，體細(xì)胞核要經(jīng)歷一個回復(fù)到早期胚胎核狀態(tài)的過程，也就是“重編程”。只有將這個過程控制好，才能提高體細(xì)胞胚胎的發(fā)育率。

協(xié)同作戰(zhàn)

說個小故事。因?yàn)槠脚_的猴子是在室溫下養(yǎng)的，所以低溫或者酷暑的時候，大家都特別擔(dān)心。2016年抗洪救災(zāi)那一次，記得那是一個周末，神經(jīng)所每個小時都與我們聯(lián)系，包括晚上。星期天下午兩點(diǎn)，水位已經(jīng)很危險了，當(dāng)時只能出人不能進(jìn)人。所里領(lǐng)導(dǎo)擔(dān)心我們，他對我說：“儀器、猴子不用管了，你們趕快撤?！?/p>

但等我們再次通話時，我告知他儀器已經(jīng)搬回原處。他當(dāng)時很驚訝，問我撤到哪里，可以如此快回來。我說：“撤的是女同胞，而男生都在那里等著?！敝挥袚碛羞@種熱愛集體、國家利益大于自己利益的精神，才會取得重大突破。

在嘗試各種調(diào)控方法效果均不理想后，2014年，我們在一篇報道中看到一種新的酶處理方法，并最終用這一方法將囊胚率提升到45%，優(yōu)質(zhì)胚胎率升高到29%。最終，我們用127枚卵母細(xì)胞，做了109個重構(gòu)胚胎，對21只猴子受體進(jìn)行移植，獲得6只懷孕受體，最后只有兩只在2017年順利出生。

世界前沿難題的突破需要精干高效的攻關(guān)團(tuán)隊(duì)?！爸就篮稀笔亲屛覀兡茉谝黄鹌床年P(guān)鍵。作為“隊(duì)長”的我，必須與團(tuán)隊(duì)同甘共苦，而不是發(fā)號施令的“老板”，我和大家一起生活在基地，同吃同住。對新手，我會手把手地從零開始教，讓他們快速成長，同時培養(yǎng)他們的使命感、榮譽(yù)感和歸屬感。

在我的團(tuán)隊(duì)，學(xué)位、出身都是虛浮之物，他們大多沒有光鮮奪目的背景，但經(jīng)過我們平臺的培訓(xùn)和自己的大膽探索以后，他們都成為了“身懷絕技”的頂尖人才，在各自崗位上發(fā)揮著核心作用。正是大家“協(xié)同作戰(zhàn)”，才使得我們最終走向了成功。

2017年底，在歷盡5年艱辛后，終于有了回報，世界上首批體細(xì)胞克隆猴“中中”和“華華”順利誕生了，該工作也被評價為：“新的里程碑”式的突破。

關(guān)于取名

大家對“中中”“華華”的名字非常感興趣，外媒也解讀“中華”的名字。

當(dāng)時蒲慕明院士和我們團(tuán)隊(duì)討論，如果這篇學(xué)術(shù)論文出去投稿，這兩個克隆猴寶寶應(yīng)該有名字，叫什么好呢？蒲院士看著我和劉真說：你們有“特權(quán)”，一人起一個，叫“強(qiáng)強(qiáng)”“真真”，寓意“真強(qiáng)”？我們二人幾乎同時搖頭，都說讓蒲院士起名字。

他想了一會兒，問“中華”如何？“中中”“華華”。我們齊聲說好！雖然起名字只有幾分鐘，但后來想想，中華復(fù)興夢在大家心里已經(jīng)藏了很久。

克隆猴體細(xì)胞的成功得益于天時、地利、人和，缺一不可。

掌握了體細(xì)胞克隆猴的技術(shù)只是開始，接下來我們會組織更多的力量，盡早研制出國際上首批用體細(xì)胞克隆猴技術(shù)研發(fā)的疾病模型猴和工具猴。

展望未來，我們將再接再厲，在體細(xì)胞克隆猴領(lǐng)域不斷產(chǎn)生原創(chuàng)性的重大突破，搶占國際上疾病克隆猴模型發(fā)展的先機(jī)，力爭在世界上最先獲得阿爾茨海默病、帕金森綜合征等腦疾病的克隆猴模型，為腦疾病的機(jī)理研究、干預(yù)、診治貢獻(xiàn)自己的力量。

此外，我們也將積極探索相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，推動我國率先發(fā)展出基于非人靈長類疾病動物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，推進(jìn)重大腦疾病、免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程，為人類的健康和中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展貢獻(xiàn)力量。

后記：

2019年1月，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)與同屬于中科院腦智中心的張洪鈞團(tuán)隊(duì)合作，再獲佳績：在利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型的基礎(chǔ)上，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)通過一只癥狀最明顯的公猴的體細(xì)胞克隆出5只小猴。這項(xiàng)進(jìn)展說明，中國科學(xué)家已可以批量生產(chǎn)遺傳背景均一的疾病獼猴模型。