LC-MS/MS法測定火鍋食品中5種罌粟殼生物堿的不確定度評定

衛(wèi)星華 李小紅 董曼曼 孫 曉 張荻悅 張亞鋒

(西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054)

罌粟殼是植物罌粟的干燥成熟果殼，其含有多種生物堿類物質(zhì)，加入食品中會使人覺得更加美味，然而長期食用添加了罌粟殼的食品，會使人成癮，給身體造成一定的損害，甚至導(dǎo)致死亡[1]。目前罌粟殼已被衛(wèi)生部列入食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中，禁止添加于火鍋底料及小吃類食品中，并針對其含有的5種主要生物堿成分制定了相關(guān)的檢驗標(biāo)準(zhǔn)[2]。

在測量及評定過程中往往存在各種各樣的影響因素[3-5]，不但影響測評結(jié)果，也影響與之相關(guān)的司法裁決、行政決定、仲裁結(jié)果等評判的正確性[6]。研究參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7-9]，通過建立數(shù)學(xué)模型，對火鍋食品中5種罌粟殼生物堿含量的不確定度來源進(jìn)行討論，以期為該檢測方法及結(jié)果的準(zhǔn)確度提供數(shù)據(jù)支持，并為實驗室質(zhì)量控制及其他非法添加的檢測提供不確定度評定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火鍋底料：市售抽檢樣品；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

甲酸、甲酸銨、無水硫酸鎂、無水醋酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗用水為超純水；

嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品：99.8%，中國藥品生物制品檢定所；

鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品：99.9%，德國Sigma-Aldrich公司；

蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)品：100%，中國藥品生物制品檢定所；

可待因標(biāo)準(zhǔn)品(液標(biāo))：99.88%，德國Sigma-Aldrich公司；

那可丁標(biāo)準(zhǔn)品：100%，中國藥品生物制品檢定所；

嗎啡-D3標(biāo)準(zhǔn)品、可待因-D3標(biāo)準(zhǔn)品(液標(biāo))：100%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1200型液相色譜儀，Agilent 6410B Triple Quad LC/MS型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配ESI離子源及MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件，美國Agilent公司；

電子分析天平：ME204E及MS105型，美國Mettler Toledo集團(tuán)公司；

純化水機(jī)：Milli-Q型，密理博中國有限公司；

超聲波清洗器：KQ-700VDB型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，用含0.5%甲酸的甲醇溶液配成罌粟堿、那可丁、蒂巴因和嗎啡含量均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。嗎啡-D3、可待因-D3 和可待因均為液標(biāo)，直接作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液使用。分別準(zhǔn)確吸取粟堿、那可丁、蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL，嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)儲備液各5 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為40 μg/mL和嗎啡、可待因濃度為200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5，2，1 mL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.2 mL，用乙腈分別定容至10 mL容量瓶中。另吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，用乙腈定容至10 mL容量瓶中，作為中間標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吸取中間標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1，0.2，0.3，0.5 mL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.2 mL，用乙腈分別定容至10 mL容量瓶中。得到罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為0.4，0.8，1.2，2，4，8，20 ng/mL，嗎啡、可待因濃度為2，4，6，10，20，40，100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)溶液濃度均為40 ng/mL。

1.3.2 樣品處理方法 稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入0.3 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入5 mL水。渦旋30 s，準(zhǔn)確加入15 mL乙腈，渦旋1 min，超聲30 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉，立即渦旋2 min，以6 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜作為待測樣品。

1.3.3 色譜條件 流動相：A相為乙腈，B相為含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，按0.0～0.3 min，90% A；0.3～1.0 min，90%～75% A；1.0～3.5 min，75% A；3.5～4.0 min，75%～90% A；4.0～7.0 min，90% A進(jìn)行梯度洗脫。色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18MGⅢ，2.0 mm×150 mm，5 μm；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；離子化方式：電噴霧電離； 掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；5種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件詳見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及經(jīng)處理后的樣品進(jìn)樣，罌粟堿、那可丁和蒂巴因采用外標(biāo)法定量，嗎啡和可待因為內(nèi)標(biāo)法定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將所得樣品數(shù)據(jù)帶入曲線，計算得到樣品中5種物質(zhì)的含量。

表1 5種目標(biāo)化合物及2種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件?Table 1 Mass spectrometry conditions of 5 target compounds and 2 internal standards

? *為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

根據(jù)模型建立原理及檢測過程，計算火鍋食品中5種罌粟殼生物堿的含量，罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標(biāo)法定量，可待因和嗎啡采用內(nèi)標(biāo)法定量，樣品含量按式(1) 計算。

式中：

X——試樣中5種生物堿的含量，μg/kg；

c——試樣溶液中5種生物堿的濃度，μg/L；

V——定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

r——回收率，%。

2.2 來源分析

由2.1中模型可知，測定不確定度主要來自以下幾個方面：① 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程所引入的不確定度，主要為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量urel(m標(biāo))及量具使用urel(V標(biāo))引入的不確定度；② 繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度urel(C標(biāo)曲)；③ 樣品前處理過程引入的不確定度，主要為樣品稱量urel(m樣)及樣品提取urel(V樣)引入的不確定度；④ 樣品的重復(fù)性引入的不確定度urel(f)；⑤ 由液質(zhì)聯(lián)用儀使用引入的不確定度urel(f液質(zhì))；⑥ 回收率引入的不確定度urel(r)。其中各不確定度分量相互獨(dú)立，被測樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成公式為：

(2)

2.3 各不確定度分量的分析與計算

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程所引入的不確定度

(1) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度：采用十萬分之一天平，根據(jù)檢定證書，影響其不確定度的主因素及相關(guān)分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算結(jié)果如表2所示。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書未給出其誤差范圍，故在計算中可忽略。

表2 天平(d=0.01 mg)稱量引入的不確定度Table 2 Standard uncertainty of balance (d=0.01 mg) measurement

其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(m天平)=

6.78×10-5g。

采用減重法分兩步稱取標(biāo)準(zhǔn)品，以嗎啡為例，2次稱取數(shù)值分別為42.43，31.80 mg，以均勻分布計算，則嗎啡的相對不確定度為：

urel(m嗎啡)=[(6.78×10-5)/(42.43×10-3)]2+[(6.78×10-5)/(31.80×10-3)]2=2.66×10-3。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對不確定度計算結(jié)果見表3，可待因為液標(biāo)無稱量過程，故無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對不確定度。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對不確定度計算結(jié)果Table 3 Standard uncertainty of material weighing

(2) 量具使用引入的不確定度：量具的使用及溫度是影響其不確定度分量的主要因素，由3部分組成：容量允差u(V1)、估讀誤差u(V2)及使用與配制時的溫度u(V3)影響。

實驗室溫度為20 ℃(在±5 ℃之間變動)，按照均勻分布，查得20 ℃的膨脹系數(shù)(α)，甲醇為1.2×10-3，甲酸為1.03×10-3，乙腈為1.37×10-3，玻璃為2.5×10-4。由于含0.5%甲酸的甲醇溶液中甲酸含量較小，可忽略不計。玻璃量具的體膨脹系數(shù)明顯小于液體的膨脹系數(shù)，可忽略不計。根據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定內(nèi)容，所用量具均為A級，歐洲分析化學(xué)中心(EURACHEM)認(rèn)為其服從三角分布，計算各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，以A類1 mL單標(biāo)線吸量管為例進(jìn)行計算：

嗎啡、可待因配置過程中1 mL單標(biāo)線吸量管使用次數(shù)為4次(一根吸量管多次使用)，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

8.88×10-3。

罌粟堿、蒂巴因、那可丁使用次數(shù)為5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

9.96×10-3。

根據(jù)表4中不同量具的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程，計算配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表5。

2.3.2 擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線產(chǎn)生的不確定度 對標(biāo)曲7個不同濃度的點分別測定1次，得到相應(yīng)的色譜峰面積A，擬合線性回歸方程為A=aC+b(a，b分別為斜率和截距)，測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表6所示。嗎啡、可待因采用內(nèi)標(biāo)法，嗎啡-D3濃度為76.68 ng/mL，峰面積為2 283，2 308，1 949，2 288，2 186，2 048，2 286；可待因-D3濃度為79.92 ng/mL，峰面積為1 416，1 538，1 329，1 519，1 501，1 453，1 445。取一陽性樣品進(jìn)行6次重復(fù)測量，樣品中5種生物堿的平均濃度分別為罌粟堿4.331 1 ng/mL、那可丁3.899 1 ng/mL、蒂巴因3.023 3 ng/mL、嗎啡26.022 1 ng/mL、可待因23.020 1 ng/mL，由最小二乘法擬合校準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度如式(3)所示。

表4 量具使用引入的不確定度?Table 4 Standard uncertainty of measuring tool usage

? a為嗎啡；b為罌粟堿、蒂巴因、那可??；c為可待因。

表5 配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 5 Standard uncertainty of standard series solution configured

(3)

式中：

a——曲線的斜率；

b——曲線的截距；

x——樣品的平均濃度，ng/mL；

C——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的平均值，ng/mL；

n——標(biāo)曲的測定次數(shù)，n=7；

P——樣品的測定次數(shù)，P=6；

i——不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的下角標(biāo)。

擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行樣品測量所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表7。

2.3.3 樣品前處理及測量引入的不確定度

(1) 樣品稱量引入的不確定度：采用萬分之一天平，其影響因素及計算與“2.3.1(1)”中有關(guān)過程相同。根據(jù)檢定證書，各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表8所示。

平行稱取2份樣品，稱樣量分別為2.027 2，2.003 8 g，則樣品稱量引入的相對不確定度為：

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)Table 6 Standard curve data

表7 配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 7 Standard uncertainty of standard series solution configured

表8 天平(d=0.1 mg)稱量引入的不確定度Table 8 Standard uncertainty for balance (d=0.1 mg) measurement

使用量具定容過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(V樣)=

2.003 8=2.64×10-2。

2.3.4 樣品重復(fù)性引入的不確定度 樣品重復(fù)性引入的不確定度包含了c、V和m測量時的重復(fù)性不確定度的分量，屬A類評定。對樣品進(jìn)行6次測定的值及其平均值及應(yīng)用貝塞爾公式計算單次測量結(jié)果的試驗標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)結(jié)果見表9。

樣品重復(fù)性引入的相對不確定度為：

urel(f罌粟堿)=6.22×10-2/4.340 2=1.43×10-2；

urel(f那可丁)=8.26×10-2/3.906 2=2.11×10-2；

urel(f蒂巴因)=6.75×10-2/3.023 6=2.23×10-2；

urel(f嗎啡)=1.88/26.023 2=7.22×10-2；

urel(f可待因)=1.77/23.015 7=7.69×10-2。

2.3.5 由液質(zhì)聯(lián)用儀使用引入的不確定度 由校準(zhǔn)證書上可知，Agilent 1200-6410液質(zhì)聯(lián)用儀的峰面積重復(fù)性為0.7%，則其相對擴(kuò)展不確定度為0.7%，按均勻分布計算，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.6 樣品回收率引入的不確定度 對上述樣品進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗，將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白樣品中，照1.3.2方法處理，即得加標(biāo)回收樣品，并對加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，樣品添加水平及所得回收率如表10所示。

用貝塞爾公式計算回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，樣品回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表9 樣品數(shù)據(jù)Table 9 Analytical results of sample

表10 樣品回收率Table 10 The recovery rate of sample (n=6)

采用t檢驗對平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗。

5種成分的t值與95%置信度，n—1自由度的雙邊臨界值比較，結(jié)果均大于2.571，說明r與100%有非常顯著差異，必須在計算公式中采用回收率校正因子r修正結(jié)果。

2.3.7 罌粟殼中5種生物堿的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度 各不確定分量相互獨(dú)立，按式(2)計算可得相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表11所示。

由模型和2次獨(dú)立樣品的試驗結(jié)果，計算得到2份火鍋食品中5種物質(zhì)的含量分別為罌粟堿31.1 μg/kg、嗎啡179.0 μg/kg、那可丁28.5 μg/kg、蒂巴因22.2 μg/kg、可待因171.0 μg/kg，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表11 5種生物堿的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 11 Standard uncertainty of 5 alkaloids

取包含因子k=2，包含概率95%，計算擴(kuò)展不確定度可得：

U罌粟堿=k×U罌粟堿(X)=2×1.2=2.4 μg/kg。

同法可得：

U嗎啡=22 μg/kg，U那可丁=2.0 μg/kg，U蒂巴因=1.9 μg/kg，U可待因=22 μg/kg。

因此，液質(zhì)聯(lián)用法測定火鍋食品中5種生物堿測量結(jié)果可表示為：罌粟堿(31.1±2.4) μg/kg，k=2；嗎啡(179±22) μg/kg，k=2；那可丁(28.5±2.0) μg/kg，k=2；蒂巴因(22.2±1.9) μg/kg，k=2；可待因(171±22) μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

試驗評定了液質(zhì)聯(lián)用法測定火鍋食品中5種罌粟殼生物堿含量的不確定度，根據(jù)各分量不確定度的計算結(jié)果可以得出，影響檢測結(jié)果不確定度的主要因素有樣品回收率，樣品平行試驗重復(fù)性，樣品提取，校準(zhǔn)曲線擬合，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制。從校準(zhǔn)曲線擬合這一不確定度分量可以看出，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定的嗎啡和可待因相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度明顯小于其他3種物質(zhì)。在試驗中，建議通過以下幾個方面來降低檢測結(jié)果的不確定度：① 減少量具使用次數(shù)并規(guī)范估讀量具讀數(shù)至最小分度值的1/5～1/10，可以降低量具引入的測量不確定度；② 對需檢測成分加入內(nèi)標(biāo)定量，可以降低不同樣品基質(zhì)所引入的不確定度；③ 被測樣品濃度均值應(yīng)接近所配制的罌粟堿等5種物質(zhì)工作曲線的中間位置，以降低標(biāo)準(zhǔn)曲線變動引入的測量不確定度；④ 提高人員操作熟練程度，可以適當(dāng)降低樣品重復(fù)性所引入的不確定度；⑤ 試驗前提前穩(wěn)定儀器狀態(tài)并定期對所涉儀器進(jìn)行檢定，使儀器保持較高的靈敏度及穩(wěn)定性，可以降低儀器引入的不確定度。