梅花鹿茸血凍干粉的安全性評價及緩解體力疲勞功能研究

秦 珩 李世芬 胡 奇 環(huán) 飛

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 211166；2. 江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評價與研究中心，江蘇 南京 211166)

鹿茸為梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角，為傳統(tǒng)中藥材，富含多肽、脂肪酸、氨基酸、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)，其中氨基酸成分占總成分的50%以上[1]。研究者[2]在鹿茸中發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)胞生長因子，諸如胰島素樣生長因子、神經(jīng)生長因子、鹿茸多肽等。其中鹿茸多肽可明顯加速骨組織的再生以及創(chuàng)面的愈合[3]，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)[4]，改善認(rèn)知功能障礙[5]。鹿茸不同部位的水提液對細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，并且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應(yīng)[6]。鹿茸血為采割馬鹿或梅花鹿茸后用真空泵或者分離機(jī)從鹿茸中提取出來的血液，其營養(yǎng)成分較多，尤其是鉀、鈣、鎂、鐵、鋅含量較高，其中鈣、鐵、鋅含量明顯高于鹿茸中的含量[7]，因此鹿茸血的營養(yǎng)要高于鹿茸。鹿茸血中營養(yǎng)成分高主要是由于血液是供給機(jī)體營養(yǎng)的運(yùn)送源，血液含有22種無機(jī)元素，18種氨基酸[8]，因此鹿茸血同樣含有多樣營養(yǎng)元素[9]，且具有緩解骨質(zhì)疏松[10]，減輕免疫耐受性，限制移植瘤增長速度的功效[11]。但關(guān)于鹿茸血安全性的評價未見報道。試驗(yàn)擬通過小鼠急性毒性試驗(yàn)、30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)、小鼠三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)等對梅花鹿茸血凍干粉的安全性進(jìn)行評價，并依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》[12]的規(guī)定對梅花鹿茸血緩解小鼠體力疲勞功能進(jìn)行研究，以期為鹿茸血的安全性及緩解體力疲勞作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品

梅花鹿茸血凍干粉：南京中科藥業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102：Molecular Toxicology, Inc.；

S-9(大鼠肝勻漿S-9)：江蘇齊氏生物科技有限公司；

血漿尿素測定試劑盒、肝糖原測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 試驗(yàn)動物

急性毒性試驗(yàn)選用的小鼠：生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2016-0002，合格證編號201603830，南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心；

30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)與緩解體力疲勞試驗(yàn)選用SPF級健康離乳SD大鼠及SPF級CI/F1代健康雄性小鼠：生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016，合格證編號2008001662204、2008001664130，上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司；

小鼠微核試驗(yàn)及精子畸形試驗(yàn)的小鼠：生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2012-0004，合格證編號201605533、201604137，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.1.4 儀器與設(shè)備

電子天平：T-1000型，常熟市雙杰測試廠；

電熱培養(yǎng)箱：DNP-9162BS型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Spectra Max M2e型，美國Molecular Devices公司；

全自動生化分析儀：7100型，日立高新技術(shù)(上海)國際貿(mào)易有限公司；

血液分析儀：ADVIA 2120i型，德國Siemens公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)(最大耐受量法) 20只SPF級ICR健康成年小鼠，雌雄各半，體重為18.9～21.8 g。給樣前禁食16 h。直接用無菌水配制梅花鹿茸血凍干粉，最大可配制濃度為0.375 g/mL，按最大灌胃量20 mL/(kg·BW)分兩次給樣，每次間隔4 h，劑量為15.000 g/(kg·BW)。給樣后觀察并記錄是否有中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)14 d。

1.2.2 Ames試驗(yàn) 在有代謝活化和無代謝活化條件下采用平板摻入法。選取經(jīng)鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100 和 TA102。β-萘黃酮和苯巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠肝S-9作為活化系統(tǒng)，其蛋白含量為30 mg/mL。設(shè)自發(fā)回變組(陰性對照)，溶劑對照組(溶劑為二甲亞砜，0.1 mL/皿)，陽性對照組：不加S-9的活化系統(tǒng)中所用的陽性物為2,4,7-三硝基芴銅0.2 μg/皿(TA97、TA98)和甲基磺酸甲酯1.0 μL/皿(TA100、TA102)，加S-9的活化系統(tǒng)中所用的陽性物為2-氨基芴10 μg/皿(TA97、TA98、TA100)和1,8-二羥基蒽醌50 μg/皿(TA102)。梅花鹿茸血凍干粉5 000，1 000，200，40，8 μg/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn)，分別在加與不加S-9的情況下每個劑量組做3個平行。如果受試樣品組的回變菌落數(shù)達(dá)到陰性對照組回變菌落數(shù)2倍及以上，并有劑量—反應(yīng)關(guān)系則該試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 梅花鹿茸血凍干粉試驗(yàn)組為1 875，3 750，7 500 mg/(kg·BW) 3個劑量，陰性對照組以無菌水代替，以20 mL/(kg·BW)進(jìn)行灌胃，陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺[40 mg/(kg·BW)]。采用30 h 進(jìn)樣法，兩次進(jìn)樣間隔24 h。第2次給樣6 h后，處死動物制片。顯微鏡下計數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，并計算微核率。每只大鼠計數(shù)200個嗜多染紅細(xì)胞時所觀察到的成熟紅細(xì)胞數(shù)(NCE)，并計算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比例(PCE/NCE)。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 梅花鹿茸血凍干粉試驗(yàn)組為1 875，3 750，7 500 mg/(kg·BW) 3個劑量，陰性對照組以無菌水代替，以20 mL/(kg·BW)進(jìn)行灌胃，陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺[40 mg/(kg·BW)]。每天給樣1次，連續(xù)進(jìn)行5 d。動物在第一次給樣后的第35天被處死，取兩側(cè)附睪的精子濾液進(jìn)行制片。顯微鏡下計數(shù)1 000個結(jié)構(gòu)完整的精子，記錄其中精子畸形的類型和數(shù)量，計算精子畸形率。

1.2.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn) 將80只SPF級健康斷奶SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組，雌雄各半。通過逐步稀釋樣品的方法將梅花鹿茸血凍干粉摻入基礎(chǔ)飼料中，按體重的10%折算。梅花鹿茸血凍干粉以0.6，1.3，2.0 g/(kg·BW·d)3個劑量摻入基礎(chǔ)飼料的百分含量分別為0.6%，1.3%，2.0%，連續(xù)喂養(yǎng)30 d后采集血樣進(jìn)行常規(guī)血液檢查、生化檢查，同時進(jìn)行大體解剖和組織病理學(xué)檢查。

1.2.6 緩解體力疲勞作用 選用SPF級CI/F1代健康雄性小鼠160只，按體重隨機(jī)分為4個組，每組40只，以梅花鹿茸血凍干粉0.1，0.2，0.6 g/(kg·BW·d)的劑量，小鼠每天灌胃1次，陰性對照組給予相同體積的溶劑，灌胃量為0.1 mL/(10 g·BW)，持續(xù)30 d。

(1) 第1組小鼠在最后一次給樣30 min后，每只小鼠尾根部負(fù)重5%體重的鉛絲，置于游泳箱中游泳。以小鼠游泳開始至死亡時間作為負(fù)重游泳時間。

(2) 第2組小鼠在最后一次給樣30 min后，置于游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，休息60 min后立即眼眶采血。血液離心后，吸取20 μL血漿，用二乙?！糠y定血漿尿素值。

(3) 第3組小鼠在最后一次給樣30 min后，立即處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟配制成1%肝勻漿液，取1%肝勻漿液0.1 mL，加2 mL蒽酮試劑，煮沸5 min，冷卻后在620 nm波長比色測定，根據(jù)所稱取的肝臟重量計算肝糖原含量。

(4) 第4組小鼠在最后一次給樣30 min后眼眶采血。然后于游泳箱中不負(fù)重游泳10 min后撈起，再次眼眶采血，休息20 min后第3次采血，用血乳酸分析儀測定各時點(diǎn)血乳酸含量，并計算血乳酸曲線下面積。

血乳酸曲線下面積按式(1)計算。

S=1/2×[(OD1+OD2)×10+(OD2+OD3)×20]，

(1)

式中：

S——血乳酸曲線下面積；

OD1——游泳前血乳酸值，mmol/L；

OD2——游泳10 min后的血乳酸值，mmol/L；

OD3——休息20 min后的血乳酸值，mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對各組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對滿足均勻方差要求的數(shù)據(jù)用單因素方差分析方法中多個試驗(yàn)組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計處理。采用秩和檢驗(yàn)法處理方差不齊的數(shù)據(jù)資料，P<0.05為差異顯著。用泊松分布U檢驗(yàn)法對骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用秩和檢驗(yàn)法對小鼠精子畸形結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

由表1可見，在觀察期內(nèi)未見有動物死亡，且梅花鹿茸血凍干粉對小鼠體重?zé)o明顯影響。梅花鹿茸血凍干粉小鼠急性經(jīng)口毒性劑量>15 g/(kg·BW)，樣品為無毒級。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中關(guān)于急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)，梅花鹿茸血凍干粉屬于無毒級。

表1 小鼠急性經(jīng)口毒性Table 1 Acute oral toxicity in mice (n=10)

2.2 Ames試驗(yàn)

由表2可見，梅花鹿茸血凍干粉各劑量組回變菌落數(shù)均不超過陰性對照組的2倍，且不存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。因此認(rèn)為在加與不加S-9時梅花鹿茸血凍干粉對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗(yàn)菌株無致基因突變作用。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

由表3可見，梅花鹿茸血凍干粉各劑量組微核率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但陽性對照組微核率顯著高于陰性對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。梅花鹿茸血凍干粉各劑量組PCE/NCE比值小于陰性對照組的20%，對骨髓細(xì)胞增殖無抑制作用。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表4、5可見，梅花鹿茸血凍干粉不同劑量組精子畸形率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，陽性對照組精子畸形率明顯高于陰性對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此梅花鹿茸血凍干粉的小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.5 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

由表6～8可見，梅花鹿茸血凍干粉在連續(xù)喂飼大鼠30 d后，對雌、雄性大鼠各觀察點(diǎn)的體重?zé)o明顯影響，對各劑量組大鼠的的血液及生化指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響。梅花鹿茸血凍干粉高劑量組和陰性對照組大鼠的肝、腎、脾、胃、十二指腸、卵巢、睪丸進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查，如圖1所示，高劑量組的大鼠臟器未見有明顯的組織病理學(xué)改變。

2.6 小鼠負(fù)重游泳時間、運(yùn)動后血清尿素水平、肝糖原儲備量及血乳酸曲線下面積

小鼠負(fù)重游泳時間的長短能反映小鼠的耐力情況[13]，由表9可見，梅花鹿茸血凍干粉0.60 g/(kg·BW·d)組的小鼠負(fù)重游泳時間明顯長于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明梅花鹿茸血凍干粉具有增進(jìn)體能，增強(qiáng)耐力的作用。各劑量組小鼠運(yùn)動后的血清尿素水平與陰性對照組比較，無明顯差異。梅花鹿茸血凍干粉0.10，0.20，0.60 g/(kg·BW·d)劑量的肝糖原儲備量高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肝糖原是由許多葡萄糖分子聚合而成的物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體需要時，便可分解成葡萄糖，轉(zhuǎn)化為能量[14]。研究結(jié)果表明鹿茸血可增加肝糖原的儲備量，為機(jī)體提供更多的能量，減少劇烈體力運(yùn)動后糖原的消耗，起到緩解體力疲勞的作用。血液中的乳酸濃度在強(qiáng)烈運(yùn)動時會急劇上升，體內(nèi)的乳酸來不及處理，造成乳酸的堆積[15]，鹿茸血凍干粉0.60 g/(kg·BW·d)組的小鼠游泳前后血乳酸曲線下面積值小于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明梅花鹿茸血凍干粉能增加有氧代謝能力，促進(jìn)乳酸代謝，降低血液中乳酸濃度，使乳酸能更快速地轉(zhuǎn)化為肌肉收縮所需的能量，緩解運(yùn)動后疲勞感，與白晨等[16]的研究結(jié)果一致。

表2 Ames試驗(yàn)回變菌落數(shù)? Table 2 Ames test retrograde colony count (n=3)

? **超過陰性對照組菌落數(shù)2倍以上。

表3小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率和嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值?

Table3Incidenceofmicronucleusinbonemarrowcellsandratioofpolychromaticerythrocytetomatureerythrocyteinmice(PCE/NCE) (n=5)

性別劑量/(mg·kg-1·BW)PCE數(shù)含微核的PCE數(shù)微核率/‰PCE/NCE雌陰性對照5 00061.2±0.81.06±0.061 8755 00091.8±0.81.05±0.073 7505 00061.2±0.81.09±0.057 5005 00081.6±1.31.08±0.03陽性對照5 00010320.6±2.4??0.91±0.05雄陰性對照5 00010 2.0±1.21.08±0.051 8755 00081.6±1.11.04±0.053 7505 00071.4±0.51.05±0.087 5005 00071.4±1.11.08±0.05陽性對照5 00011422.8±4.1??0.92±0.05

? **與陰性對照組比較(P<0.01)。

表4 小鼠精子畸形率?Table 4 Rate of sperm abnormality in mice (n=5)

? **與陰性對照組比較，P<0.01。

表5 小鼠精子畸形類型及比例?Table 5 Types and proportions of sperm abnormalities in mice

? 占比為該類畸形數(shù)量占總畸形數(shù)量的百分比。

表6 大鼠體重Table 6 Weight of rats (n=10)

表7 大鼠血液學(xué)指標(biāo)Table 7 Hematological indices in rats (n=10)

圖1 組織病理學(xué)圖片F(xiàn)igure 1 Histopathological picture

性別劑量/(g·kg-1·BW)谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)總蛋白/(g·L-1)白蛋白/(g·L-1)尿素氮/(mmol·L-1)肌酐/(μmol·L-1)總膽固醇/(mmol·L-1)甘油三酯/(mmol·L-1)血糖/(mmol·L-1)雌0.033±6130±3055.3±1.637.7±0.87.72±1.3637±42.19±0.370.47±0.115.82±1.190.633±4125±1457.1±2.438.6±1.27.80±1.4637±72.11±0.160.43±0.065.61±0.361.337±12142±2156.0±1.837.9±1.28.62±1.7243±82.09±0.310.50±0.166.08±0.652.036±4141±1155.9±2.137.6±0.79.42±2.1637±42.05±0.300.44±0.116.20±0.49雄0.041±7149±2854.5±1.236.5±0.76.07±0.9931±61.46±0.300.66±0.196.14±1.300.645±5149±2154.7±1.336.6±0.85.94±0.8728±31.57±0.280.84±0.256.64±0.831.347±8150±2854.3±0.936.5±0.55.82±0.5030±31.49±0.250.75±0.096.36±1.132.042±8156±2553.8±1.936.3±1.05.94±0.5330±31.44±0.350.79±0.176.73±1.30

表9小鼠負(fù)重游泳時間、血漿尿素水平、肝糖原儲備量、血乳酸曲線下面積?

Table9Weight-bearingswimmingtime,plasmaurealevel,hepaticglycogenreserveandareaunderbloodlacticacidcurveinmice(n=10)

劑量/(g/kg-1·BW·d-1)負(fù)重游泳時間/s血漿尿素/(mmol·L-1)肝糖原/(mg·g-1·Liver)血乳酸曲線下面積值0.00448±1557.98±0.6210.3±6.297±140.10587±1778.33±0.5422.5±2.4??86±220.20591±1408.26±0.4321.1±5.4??83±120.60661±163?7.47±0.5417.4±5.8?78±10?

? *與陰性對照組比較，P<0.05；**與陰性對照組比較，P<0.01。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，梅花鹿茸血凍干粉食用安全性，且具有緩解小鼠體力疲勞功能。推測是因?yàn)槁谷籽凶鳛檠旱鞍讈碓吹幕钚噪木哂卸喾N生理活性[17]，尤其是含有的睪酮具有維持肌肉強(qiáng)度及質(zhì)量、提升體能等作用[18]。試驗(yàn)僅從動物試驗(yàn)的角度證實(shí)了鹿茸血凍干粉的安全性及緩解體力疲勞的作用，鑒于動物與人類之間的差異，對于人類食用來說是否安全及是否有明確的緩解體力疲勞作用還需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。