庫爾勒香梨黑頭病病原菌的分離鑒定

歐陽輝 張偉達 程少波

摘要：為了分離、鑒定庫爾勒香梨黑頭病病原菌，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等手段對致病菌進行鑒定，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板法對致病菌株進行分離純化，觀察病原菌株的菌落特征，通過顯微鏡觀察病原孢子形態(tài)特征，并根據(jù)回接試驗確定其致病性能。結(jié)果表明，從病梨萼端表面及香梨生長環(huán)境中共分離出11株菌株，綜合病原菌菌落形態(tài)、孢子顯微結(jié)構(gòu)及回接試驗，篩選出2株候選菌株（SY-6、XL-6），其回接香梨的病癥與正常發(fā)病的香梨較相似。通過十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法提取病原菌DNA，經(jīng)rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS-rDNA）基因片段測序及美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）網(wǎng)站的同源性比對，鑒定得出SY-6、XL-6均屬于鏈格孢屬。結(jié)果共分離出2株鏈格孢屬病原菌，致病癥狀與自然發(fā)病的香梨較相似，結(jié)果與筆者所在課題組的前期研究結(jié)果相吻合，從而為研究病原菌致病機制提供了參考。

關(guān)鍵詞：庫爾勒香梨;黑頭病;致病菌;鑒定

中圖分類號： S436.612.1+9 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0116-04

庫爾勒香梨是新疆地區(qū)最主要的特色果品之一，由于其皮薄汁豐、品質(zhì)優(yōu)良而享譽全國。新疆得天獨厚的地理優(yōu)勢和氣候條件造就了庫爾勒香梨獨特的口感和品質(zhì)，庫爾勒香梨果實大小適中，形如紡錘，果皮黃綠，果味濃芬，果肉酥脆爽口，清甜多汁，其含糖量約為10%，含水量約為86%，同時富含多種維生素[1]。庫爾勒香梨不但具有很高的食用價值，還有潤肺、涼心、消疾、驅(qū)毒、切片貼燙火傷止痛不爛等藥用功效，深受廣大消費者青睞。

近年來，新疆香梨的種植面積及貯藏容量在逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，截至2016年，新疆香梨種植面積達7萬hm2，產(chǎn)量為114萬t[2]，2016年僅出口產(chǎn)值便達407.62萬美元。由于經(jīng)濟價值高、種植面積不斷擴增、產(chǎn)量高，香梨的貯藏保鮮成為一個關(guān)鍵問題，經(jīng)過多年技術(shù)攻關(guān)，貯藏冷庫成為目前果農(nóng)的一項選擇，但是香梨在貯藏過程中容易受到病害影響，例如凍害、病蟲害、褐斑病、輪紋病、炭疽病、青霉病、褐腐病及黑頭病等[3]，這些病害嚴重降低了商品價值，尤其是庫爾勒香梨黑頭病，其發(fā)病率高達10%，已經(jīng)成為制約香梨鮮果品質(zhì)提升的主要問題。2011年，唐文娟等通過對黑頭病病原菌致病性的研究發(fā)現(xiàn)，其主要侵染特征[4]表現(xiàn)為果實萼端深綠色，且硬度較高;發(fā)病初期萼端果皮變黑色，表皮切開后可發(fā)現(xiàn)果肉有淺褐色蜂窩狀壞死現(xiàn)象，且表觀呈現(xiàn)未病變狀態(tài)的果肉組織略有苦味;發(fā)病后期黑頭部位稍有塌陷，萼端產(chǎn)生黑色霉層，病斑邊緣處果皮變?yōu)楹谏“吲c內(nèi)部好果肉的交界非常明顯，呈蜂窩狀的黑頭病部位在伴隨黏稠黑汁狀物質(zhì)產(chǎn)生的同時，存在侵染性腐爛由果皮向果肉逐漸擴散的現(xiàn)象。由于該疾病在香梨貯藏期間高發(fā)，同時又嚴重影響香梨的貯藏品質(zhì)，所以為了降低香梨發(fā)病造成的經(jīng)濟損失，同時避免這種病害長期存在，對黑頭病致病菌的研究是非常必要的。

本研究采用分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法對病原菌進行鑒定，以期為香梨黑頭病抗病機制的研究及防治提供理論依據(jù)，從而降低黑頭病發(fā)病率，延長香梨貯藏時間，提高香梨品質(zhì)并促進其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用庫爾勒香梨（健康果及病果）均于2016年采自庫爾勒市冷藏庫及氣調(diào)庫;庫爾勒香梨樹葉及土壤樣本采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二師28團香梨果園。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[5]，購自青島海博生物技術(shù)有限公司;十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）提取液（200 mL）[6]，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;DNA純化試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS），購自北京博奧拓達科技有限公司;酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，購自北京索萊寶科技有限公司;Gold View，購自北京博奧拓達科技有限公司。

LabCycler-PCR擴增儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Thermo Fisher Scientific）;QUANTUM ST4全自動凝膠成像儀，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司;1645056高壓電泳儀，北京六一生物科技有限公司;FRESCO 21離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 菌株的分離純化及保存

1.2.1 環(huán)境中病原菌的篩選 準確稱取10.0 g土壤樣品，于PDA液體培養(yǎng)基中富集，在搖床上于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，吸取200 μL培養(yǎng)液至PDA固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，于28 ℃倒置培養(yǎng)。從梨樹枝條上摘取大小形態(tài)完整、無明顯病態(tài)的葉片，用75%乙醇棉球擦拭表面，再用無菌水沖洗3次后自然晾干。用滅菌的打孔器取直徑為0.5 cm的葉片切片，放置于PDA固體培養(yǎng)基中，于28 ℃倒置培養(yǎng)。待長出菌落后，將所有菌落采用劃線法或點植法轉(zhuǎn)接純化，直至出現(xiàn)單一穩(wěn)定的菌落。菌落每次轉(zhuǎn)接均設(shè)3組重復(fù)。將最終分離的菌落回接未染病香梨進行致病性能的確定。

1.2.2 發(fā)病香梨表面病原菌的分離篩選 依據(jù)柯赫氏法則[7]從庫爾勒香梨的病健相接處切下3處病變組織，在PDA固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)。待長出菌落后，將所有菌落采用劃線法或點植法轉(zhuǎn)接純化5次，直至分離出菌落大小、形狀、顏色、表面光滑濕潤程度、菌絲生長速度、菌絲形狀、產(chǎn)孢情況、孢子顏色、形狀等一致的若干菌株[8]。病變香梨樣品有15個，每個香梨設(shè)3組平行，菌落每次轉(zhuǎn)接均設(shè)3組重復(fù)。最終將初分離得到的菌落回接到未致病香梨果實上得到致病香梨，進而與未致病香梨比較，進行致病性能的確定。

1.2.3 病原菌的保存 用液體培養(yǎng)法將分離純化后的致病菌培養(yǎng)至對數(shù)期，保存于50%滅菌甘油（用蒸餾水配制）中，于-80 ℃保存。與此同時，將病原菌接種在斜面固體PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將已分離純化的菌種接種在PDA固體培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)，自第4天開始觀察菌落的生長狀況。病原菌菌落形態(tài)：觀察分離培養(yǎng)基上病原菌的菌落形態(tài)（包括形狀、大小、菌落色澤、菌落表面結(jié)構(gòu)、菌落滲出物及菌落邊緣特征）。菌落形態(tài)特征的描述參照《真菌鑒定手冊》[9]《中國真菌志》[10]《植物病原真菌學(xué)》[11]及《真菌的形態(tài)和分類》[12]。

1.4 回接試驗

從氣調(diào)貯藏庫選取健康的庫爾勒香梨果實，于室溫放置6 h后，在無菌條件下，用75%乙醇棉球表面擦拭消毒，后用無菌水沖洗5次，自然晾干，進行接種。用無菌打孔器在庫爾勒香梨萼部分別打3個直徑為0.5 cm、深度為0.2 cm的孔用于接種，取相同直徑的病原菌餅接種于打孔處，將單果實獨立分裝于無菌密封袋中，室溫存放。用分離出的每個病原菌分別接種香梨果實，每個菌種為1個處理，每個處理重復(fù)3次。在25 ℃、相對濕度（RH）保持在90%以上培養(yǎng)5～15 d后對其進行觀察，若癥狀與致病香梨癥狀一樣，則初步確定該菌株為病原菌。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 病原菌的DNA提取 采用CTAB法對病原菌DNA進行提取。

1.5.2 PCR擴增病原菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS區(qū)） ITS-rDNA基因片段擴增采用通用引物，上引物為ITSF（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），下引物為ITSR（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。20 μL PCR擴增體系如下：1 μL DNA模板，0.5 μL 上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL預(yù)混液Mix，8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán);72 ℃ 7 min。

反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物，加1 μL 6×loading buffer，混勻后點樣于0.8%瓊脂糖凝膠，電泳后在紫外光下觀察特異性條帶。

1.5.3 PCR擴增產(chǎn)物的純化回收 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)全式金瓊脂糖回收試劑盒回收純化。

1.5.4 ITS區(qū)基因的克隆轉(zhuǎn)化 將回收純化產(chǎn)物與T載體（PMD19-T）連接（載體與目的片段摩爾比為1 ∶ 3），然后轉(zhuǎn)化Escherichia coli感受態(tài)，篩選陽性克隆[13]，進行測序。

1.5.5 質(zhì)粒提取及測序 篩選陽性克隆，于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，提取大腸桿菌質(zhì)粒，送相關(guān)公司測序。質(zhì)粒提取步驟參考溫建新等的大腸桿菌質(zhì)粒提取方法[14]。ITS-rDNA測序由北京華大基因研究中心完成。將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對（BLAST），獲得重復(fù)率最高的相關(guān)屬及相關(guān)種的基因序列，并根據(jù)遺傳距離計算結(jié)果繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離篩選

以貯藏于冷庫的自然發(fā)病香梨及生長環(huán)境中采集的土壤、樹葉為材料，經(jīng)分離篩選、純化，得到11株病原菌，其中從土壤中分離出1株（命名為TR-1），從樹葉中分離出5株（分別命名為SY-2、SY-3、SY-4、SY-5、SY-6），從病梨中分離出5株（分別命名為XL-2、XL-3、XL-4、XL-5、XL-6）。

通過觀察病原菌菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)2株菌SY-6、XL-6在生長初期為灰白色，氣生菌絲薄層絮狀，隨著生長時間的延長及孢子的產(chǎn)生，逐漸表現(xiàn)為淺綠色直至褐色，菌落有明顯的同心輪紋，中心突起且泛白，質(zhì)地緊致，呈氈狀，表面呈現(xiàn)溝紋狀，基底為墨綠色，生長后期培養(yǎng)基呈黑色，菌落邊緣處有1道寬約0.2～0.4 cm的白色菌絲體。這與筆者所在課題組前期研究結(jié)果，即黑頭病病原菌鏈格孢屬的菌落形態(tài)較接近，初步判定菌株SY-6、XL-6為鏈格孢屬。

2.2 病原菌的顯微觀察

通過對菌株進行顯微觀察，在高倍鏡下觀察孢子形態(tài)，由圖1可以看出，SY-6、XL-6病原菌孢子串生、有橫隔且孢子呈長卵形，與鏈格孢屬較為相似。

2.3 回接試驗

將分離純化得到的致病菌菌株（SY-6、XL-6）采用有傷回接（菌餅）法進行試驗，由圖2可知，接種后香梨的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病香梨相似。2株致病菌于庫爾勒香梨上在生長初期為灰白色，氣生菌絲薄層絮狀，隨著生長時間的延長，逐漸變?yōu)闇\綠色直至褐色，菌落有明顯的同心輪紋，中心突起且泛白，質(zhì)地緊致、氈狀，表面呈現(xiàn)溝紋狀，基底為墨綠色，生長后期培養(yǎng)基呈黑色，菌落邊緣處有1道寬約0.2～0.4 cm的白色菌絲體。初步判定病原菌株SY-6、XL-6為鏈格孢屬。

2.4 黑頭病致病菌的分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 致病菌的DNA提取及擴增 采用CTAB法提取菌株（SY-6、XL-6）的基因組DNA，并進行PCR擴增，以ITSF、ITSR通用引物擴增致病菌的ITS-rDNA，對PCR擴增產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，PCR擴增產(chǎn)物均有條帶，且條帶單一，無其他雜帶出現(xiàn)，電泳結(jié)果見圖3，根據(jù)電泳圖中marker Ⅱ分子量大小的比對可知，致病菌的ITS-rDNA基因序列片段大約為600 bp。

2.4.2 PCR產(chǎn)物回收純化 將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)全式金瓊脂糖回收試劑盒回收純化，并進行電泳檢測。由圖4可以看出，回收結(jié)果均有條帶，且條帶單一，回收效果良好。

2.4.3 克隆轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取 將純化后的DNA由T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，進行抗生素藍白選擇性培養(yǎng)，成功挑選白色單菌落，于37 ℃搖床培養(yǎng)10～12 h后，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取結(jié)果表明，SY-6、XL-6條帶清晰明亮，質(zhì)粒提取較成功，電泳檢測結(jié)果見圖5。