芫荽籽精油成分解析及其對秀麗隱桿線蟲壽命和運動的影響

徐悅 束成杰 聶韡

摘要：以水蒸氣提取法獲得芫荽籽精油，通過氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）方法檢測鑒定分析了精油的組分與含量，同時以秀麗隱桿線蟲為模式生物研究芫荽籽精油對線蟲的影響。結(jié)果表明，GC-MS檢測確定精油中有效組分有18種，其中芳樟醇含量最高，為83.43%;其次為乙酸橙花酯，為3.21%;萜品烯，為2.85%;α-蒎烯，為2.53%;樟腦，為1.33%;橙花醇，為1.11%等。動物試驗結(jié)果表明，芫荽籽精油對線蟲具有抑制作用，與對照試驗組相比，芫荽籽精油處理后的線蟲出現(xiàn)壽命縮短、運動行為能力下降、后代數(shù)目減少以及體內(nèi)ROS水平升高的變化，且2組間差異顯著，推測芫荽籽精油處理后可能導(dǎo)致線蟲神經(jīng)系統(tǒng)受損及胰島素信號通路變化是導(dǎo)致線蟲出現(xiàn)上述變化的原因。

關(guān)鍵詞：芫荽籽精油;芳樟醇;秀麗隱桿線蟲;GC-MS;ROS水平

中圖分類號：S432.4+5 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0111-05

芫荽（Coriandrum sativum L.）為一年生或兩年生的傘形科芫荽屬草本植物，最早在漢代從西方國家引入我國，目前在我國種植廣泛，不僅是美味的蔬菜，同時也是一味常見中藥材。芫荽籽可藥食兩用，其精油成分不僅可用于調(diào)配食品，還有防腐抑菌及多種疾病治療的作用[1-3]。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域研究的模式生物，具有體積小、體透明、結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、易飼養(yǎng)等特點，其神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)與哺乳動物具有高度同源性，是一種適用于化合物物質(zhì)性質(zhì)評價與機(jī)制研究的模式生物[4-5]。本研究以水蒸氣蒸餾法提取芫荽籽精油，并采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法對其成分進(jìn)行鑒定與解析;同時還研究了芫荽籽精油對秀麗隱桿線蟲壽命、運動行為能力、后代數(shù)目以及體內(nèi)活性氧水平方面的影響，以期為探究芫荽籽精油對線蟲作用影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芫荽籽采自江蘇省南京市高淳地區(qū)，由南京野生植物綜合利用研究院肖正春教授鑒定為傘形科芫荽屬的籽實，芫荽籽于2016年8月采集保存，經(jīng)干燥后粉碎過40目篩備用。秀麗隱桿線蟲（N2野生型）和OP50（尿嘧啶滲漏突變型）大腸埃希菌由東南大學(xué)惠贈，線蟲試驗工作于2017年4月在南京野生植物研究院線蟲實驗室內(nèi)開展。

瓊脂，日本制藥株式會社生產(chǎn);活性氧（ROS）試劑盒，南京建成科技有限公司生產(chǎn);膽固醇、多聚蛋白胨、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、K3PO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、NaOH、NaClO、DMSO均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

頂空氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司生產(chǎn);LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn);HCB-1300V潔凈工作臺，青島海爾特種電器有限公司生產(chǎn);SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);JW-2017HR高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司生產(chǎn);奧林巴斯顯微鏡，OlympusBX41，南京艾朗儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 芫荽籽精油提取 精確稱取芫荽籽粉末120 g置于蒸餾瓶中，加入蒸餾水進(jìn)行水蒸氣蒸餾法提取精油，料液比為1 ∶ 10，浸泡1 h后蒸餾3 h，餾出液冷凝收集，經(jīng)萃取、過濾、干燥、除雜后得樣品精油0.61 g，得油率為0.508%，使用該精油做GC-MS成分分析和秀麗線蟲體內(nèi)試驗。

1.2.2 GC-MS測定條件與成分解析[6] 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純He（99.999%），進(jìn)樣量為1 μL，分流比為60 ∶ 1，流速為1 mL/min。升溫程序：初始溫度80 ℃保留 1 min，然后2 ℃/min至180 ℃，然后5 ℃/min至220 ℃保留8 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍為全掃描。

成分解析：對照標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11檢索，用峰面積歸一法計算各組分相對百分含量。

1.2.3 芫荽籽精油對秀麗隱桿線蟲的影響

1.2.3.1 試劑的制備 線蟲生長（NGM）培養(yǎng)基的配制：3.0 g NaCl、17.0 g瓊脂、2.5 g多聚蛋白胨，溶于975 mL蒸餾水中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌、冷卻至55 ℃左右后，加入10 mL CaCl2（0.1 mol/L），10 mL MgSO4（0.1 mol/L），1 mL膽固醇（5 mg/L），25 mL K3PO4溶液（0.1 mol/L），混勻使用。

M9緩沖液的配制：3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 mL MgSO4（1 mol/L），溶于1 L蒸餾水中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用。

裂解液的配制：0.5 mol/L NaOH、2.5%（體積比）NaClO，使用時按體積比1 ∶ 1混合。

精油濃度配制：將芫荽籽精油先溶于同體積的二甲基亞砜（DMSO）中，再用M9緩沖液稀釋至所需濃度。

1.2.3.2 線蟲同步化 用涂有OP50的NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)線蟲，待成年線蟲體內(nèi)有卵時，用M9緩沖液將成蟲從培養(yǎng)基表面沖下來，吸取放入無菌EP管中，待蟲體自然沉降后吸去上清液，然后加入適量M9緩沖液洗滌3次，然后向EP管中加入1 mL裂解液，將離心管反復(fù)來回顛倒，重懸至完整的線蟲數(shù)量顯著下降，5 000 r/min離心1 min，棄上清，再加入1 mL M9緩沖液洗滌3次，離心后將沉淀轉(zhuǎn)移到新的涂有OP50的培養(yǎng)基上，放入20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3.3 線蟲存活率和壽命測定 線蟲經(jīng)同步化后培養(yǎng)至L4期成蟲時，收集該時期的線蟲，隨機(jī)分組加入到96孔板中，每孔線蟲數(shù)量相同，分別加入100 μL體積分?jǐn)?shù)為1.0%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0的芫荽籽精油樣液，置于20 ℃培養(yǎng)箱中暴露24 h后計數(shù)存活的線蟲數(shù)目，計算存活率。取暴露后的線蟲用于壽命測定，將存活的線蟲挑取到新的涂有OP50的培養(yǎng)基上，每組100條線蟲，每天記錄當(dāng)天培養(yǎng)基上存活和死亡的線蟲數(shù)目，然后將活著的線蟲挑取到新的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基上線蟲全部死亡為止（對鉑金絲刺激無反應(yīng)者記為死亡）。

1.2.3.4 線蟲運動行為測定 運動行為測定包括頭部擺動頻率、身體彎曲頻率、吞咽頻率和排泄周期4個方面。同壽命試驗方法處理收集線蟲后進(jìn)行試驗測定，每組10條線蟲。

頭部擺動頻率的測試是將線蟲轉(zhuǎn)移到含有適量M9緩沖液的NGM培養(yǎng)基上，待其恢復(fù)1 min后測試其在后20 s內(nèi)頭部擺動次數(shù)。1次成功的頭部擺動定義為其頭部擺動方向轉(zhuǎn)過其身體朝向方向。

身體彎曲頻率的測試是計數(shù)線蟲在培養(yǎng)基上20 s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)，1次成功的身體彎曲定義為以身體形成的S型中軸線為軸，向前行進(jìn)1個正弦波形的過程。

吞咽頻率的測定是計數(shù)線蟲在涂有OP50的培養(yǎng)基上 20 s 內(nèi)咽泵運動次數(shù)。

排泄周期的測定是計數(shù)線蟲在涂有OP50的培養(yǎng)基上2次排泄之間的間隔時間。線蟲的排泄孔位于尾部，排泄時尾部會發(fā)生明顯收縮，并伴有排泄物的釋放。

1.2.3.5 線蟲后代數(shù)目測定 同壽命試驗方法處理線蟲，將線蟲收集至無菌EP管中，用M9緩沖液反復(fù)沖洗3次，將蟲體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上放置1條線蟲，每天計數(shù)培養(yǎng)基上的后代數(shù)目并將該成蟲轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上，直至該成蟲不產(chǎn)生后代為止，計算每條蟲子所有后代數(shù)目的總和，每組共10條線蟲。

1.2.3.6 線蟲體內(nèi)活性氧水平測定 收集L4期線蟲，用生存率為0對應(yīng)濃度的精油暴露線蟲，然后按照ROS試劑盒的操作說明進(jìn)行試驗，用激光掃描共聚焦顯微鏡激發(fā)線蟲產(chǎn)生的熒光并拍照記錄，激發(fā)波長488 nm，測量波長510 nm。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)t-檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芫荽籽精油成分分析

水蒸氣法提取的芫荽籽精油呈淺黃色，具有濃郁的香味，經(jīng)GC-MS分析得總離子流色譜圖，經(jīng)解析鑒定，共檢出77個峰，鑒定出18種有效組分，占精油總量的97.84%，芫荽籽精油化學(xué)成分分析結(jié)果見表1。

從表1可以看出，芫荽籽精油中包含了烯萜類、醇、醛、酯等化合物成分，其中含量最高的是芳樟醇，為83.43%;其次有乙酸橙花酯，為3.21%;萜品烯，為2.85%;α-蒎烯，為 2.53%;樟腦，為1.33%;橙花醇，為1.11%;以上組分共占精油總含量的94.46%，可以判斷是芫荽籽獨特香味的主要成分。芫荽籽精油中的主要成分是芳樟醇，含量占比最高，是天然芳樟醇的重要來源，因而芳樟醇的含量成為衡量芫荽籽品質(zhì)的指標(biāo)之一。李偉等研究了黑龍江省產(chǎn)芫荽籽中芳樟醇含量為73.61%[6]。李叢民等研究了湖北省來鳳縣產(chǎn)芫荽籽中芳樟醇含量為56.82%[7]。李鋒等研究了新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)芫荽籽中芳樟醇含量為77.00%[8]。任安祥等比較研究了不同國家產(chǎn)地芫荽籽精油的芳樟醇含量，發(fā)現(xiàn)樣品中泰國產(chǎn)芫荽籽的芳樟醇含量約為78.96%～82.97%，澳大利亞產(chǎn)芳樟醇含量約為76.63%～93.50%，國產(chǎn)2種芫荽籽芳樟醇含量為 84.44%、90.49%[9]。由此可見，不同產(chǎn)地的芫荽籽中芳樟醇含量具有明顯差異，采自南京市高淳地區(qū)的芫荽籽與上述研究中芫荽籽相比較芳樟醇含量較高，屬于較優(yōu)品質(zhì)。

2.2 芫荽籽精油對秀麗線蟲的影響

2.2.1 線蟲存活率和壽命試驗 從前期試驗結(jié)果可知，不高于1%濃度的DMSO對線蟲不具有生物學(xué)影響，因而試驗以DMSO作為精油助溶劑。從表2可以看出，芫荽籽精油對線蟲的存活有顯著影響，在試驗濃度范圍內(nèi)，濃度大于等于0.6%時，線蟲的存活率為0，濃度低于 0.6% 時，線蟲的存活率會隨著濃度的降低而增大，當(dāng)精油濃度為0時線蟲的存活率為100%，由此可見，芫荽籽精油對線蟲的生存狀態(tài)有抑制作用。因此壽命、后代數(shù)量和運動行為能力試驗選擇的精油濃度為0.5%，ROS試驗選擇精油濃度為0.6%，以0濃度為空白對照組，以此來研究芫荽籽精油對秀麗隱桿線蟲壽命及運動的影響。

從圖1可以看出，空白對照組及精油處理組的線蟲壽命變化的趨勢，對照組線蟲的平均壽命為（10.72±0.33） d，精油處理組平均壽命為（9.29±0.41） d。與對照組相比，精油處理后的線蟲壽命明顯縮短，平均壽命低于對照組，處理間差異顯著，說明芫荽籽精油影響線蟲壽命，出現(xiàn)壽命縮短的現(xiàn)象。

2.2.2 線蟲運動行為能力試驗 線蟲的運動行為反映了它的生活狀態(tài)，頭部擺動頻率、身體彎曲頻率、吞咽頻率、排泄周期是線蟲主要的4種運動行為。從圖2可以看出，與對照組線蟲相比，芫荽籽精油處理后的線蟲的頭部擺動、身體彎曲、

吞咽頻率都極顯著下降（圖2-A、圖2-B、圖2-C），排泄周期明顯增長（圖2-D），處理間差異極顯著。結(jié)果表明，芫荽籽精油會對線蟲的運動行為能力產(chǎn)生抑制，使其低于正常線蟲的能力水平。

2.2.3 線蟲后代數(shù)目試驗 線蟲后代數(shù)目反映了線蟲的繁殖能力，測定后代數(shù)目可以評價芫荽籽精油對線蟲繁殖能力的影響。從圖3可以看出，對照組線蟲產(chǎn)的后代數(shù)量平均值為（197±51）個，經(jīng)0.5%濃度精油處理后的線蟲產(chǎn)的后代數(shù)量的平均值為（161±49）個，顯著低于對照組。由此可知，芫荽籽精油會影響線蟲的繁殖能力，表現(xiàn)出減少線蟲后代數(shù)目的作用。

2.3.4 線蟲體內(nèi)ROS變化 生物體正常代謝會產(chǎn)生一定濃度水平的活性氧，但高于正常水平的活性氧在體內(nèi)會對生物大分子造成氧化損傷，包括對核酸、蛋白質(zhì)以及生物膜造成氧化損傷，進(jìn)而影響生命活動，因而自由基可以反映出機(jī)體損傷程度。從圖4可以看出，ROS經(jīng)熒光探針標(biāo)記后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)芫荽籽精油處理后的線蟲體內(nèi)的ROS熒光強(qiáng)度明顯高于對照組線蟲，處理間差異顯著。說明精油處理導(dǎo)致線蟲體內(nèi)積累的ROS濃度升高。

3 討論與結(jié)論

芫荽籽精油是一種富含芳樟醇的天然植物精油，具有獨特的芳香氣味。據(jù)報道，芳樟醇是一種重要的香精香料和工業(yè)生產(chǎn)的中間體，芫荽籽是其天然來源之一[10]，因而芳樟醇含量的高低是衡量芫荽籽精油品質(zhì)好壞的指標(biāo)之一，不同地區(qū)芫荽籽精油中芳樟醇含量具有差異性。本試驗所用芫荽籽采自南京市高淳地區(qū)，采用水蒸氣法獲得精油，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，該芫荽籽精油共鑒定出18種有效組分，成分含量最高的是芳樟醇，占精油總成分的83.43%，與黑龍江省產(chǎn)的73.61%、湖北省來鳳縣產(chǎn)的56.82%、新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)的77.00%芫荽籽中芳樟醇含量相比，芳樟醇成分占比更高，品質(zhì)更好，所得芫荽籽精油成分還包括乙酸橙花酯為3.21%、萜品烯為2.85%、2-蒎烯為 2.53%、樟腦為1.33%、橙花醇為1.11%等萜類物質(zhì)，與已有報道中的鑒定成分大致相符[9，11]，但組分和含量存在差異，這些差異可能是由于不同品種遺傳上的差異，也可能是產(chǎn)地的種植環(huán)境不同造成的。

本試驗還研究了芫荽籽精油對秀麗隱桿線蟲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芫荽籽精油對線蟲的生命活動具有抑制作用，對線蟲存活率影響的IC50值介于0.4%～0.5%（體積比）之間。與對照組相比，芫荽籽精油對線蟲生命活動會造成明顯抑制作用，出現(xiàn)壽命縮短、后代數(shù)目降低、運動行為能力降低的現(xiàn)象，同時對線蟲體內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)處理組線蟲體內(nèi)ROS水平明顯高于對照組，表明芫荽籽精油會誘導(dǎo)線蟲體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，可對線蟲產(chǎn)生氧化損傷。秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)由302個神經(jīng)元組成，調(diào)控著線蟲的各項生命活動，其中感覺神經(jīng)元與線蟲的行為、發(fā)育和壽命有關(guān)，運動神經(jīng)元支配著線蟲的肌肉活動，從而控制運動行為，包括頭部擺動、身體彎曲前進(jìn)等[12-13]。許云等發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)VD和AVL這2種運動神經(jīng)元的缺失會造成線蟲的身體彎曲頻率降低并且抑制排泄行為[14]。Alcedo等研究發(fā)現(xiàn)，味覺神經(jīng)元和嗅覺神經(jīng)元影響著線蟲壽命，其中除了部分味覺神經(jīng)元會抑制線蟲長壽，其他感受神經(jīng)元均與促進(jìn)線蟲壽命延長有關(guān)[15]。線蟲生理機(jī)能的協(xié)調(diào)運作還與其體內(nèi)的ILP基因家族的作用密不可分，其感受神經(jīng)元就是由ILP基因表達(dá)的，這些ILP基因還可以作為DAF-2胰島素樣受體的配體并調(diào)控下游信號級聯(lián)放大，從而調(diào)控線蟲的生理機(jī)能[16-17]。胰島素信號通路是線蟲體內(nèi)一條重要的信號通路，參與調(diào)節(jié)線蟲的壽命以及體內(nèi)的氧化應(yīng)激，主要是通過信號通路上的激素與激酶水平的上調(diào)或下調(diào)來啟動一系列細(xì)胞保護(hù)機(jī)制從而達(dá)到延長線蟲壽命的效果[18-19]。

本試驗采自南京市高淳地區(qū)的芫荽籽所制芫荽籽精油品質(zhì)較好，芳樟醇含量較高。同時本試驗首次研究了芫荽籽精油對秀麗隱桿線蟲的生物影響，結(jié)果表明，芫荽籽精油對秀麗隱桿線蟲的生命活動表現(xiàn)出一定的抑制作用，主要表現(xiàn)為對壽命、子代產(chǎn)出和運動行為有抑制作用，同時還會引起線蟲體內(nèi)活性氧積累水平升高，由此可推測芫荽籽精油對線蟲造成了氧化損傷，但具體作用機(jī)制尚不明確，根據(jù)已有文獻(xiàn)推測這可能與芫荽籽精油導(dǎo)致線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)受損、胰島素信號通路變化有關(guān)，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步試驗驗證。芫荽籽精油在眾多領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，多方位探究了解其生物活性對于更加合理利用開發(fā)芫荽籽精油有著重要意義，本研究結(jié)果可為芫荽籽精油對線蟲的抑制作用以及誘發(fā)的保護(hù)機(jī)制提供相關(guān)基礎(chǔ)，以期對芫荽籽精油生物活性作進(jìn)一步了解。

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