潰結爽灌腸組方不同組分對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠的治療中單因素效應及量效關系分析*

河北省石家莊市中醫(yī)院

鄭彩華 郭愛林△ 李 晶△ 郭光業(yè) 常玉娟 馮秀賢 張 娜(石家莊 050051)

潰結爽灌腸組方不同組分對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠的治療中單因素效應及量效關系分析*

河北省石家莊市中醫(yī)院

鄭彩華 郭愛林△李 晶△郭光業(yè) 常玉娟 馮秀賢 張 娜(石家莊 050051)

目的：通過正交試驗設計，對潰結爽組方中苦參、地榆、黃柏、白及4味中藥的單因素效應進行分析，觀察其對潰瘍性結腸炎(UC)大鼠的治療作用，并探討他們之間的量效關系及其最佳配伍，為臨床中藥灌腸組方提供依據。方法：清潔級雄性wistar大鼠70只，應用正交試驗設計，組方各因素取三水平， 選用L9(34)正交表，進行9組試驗。以葡聚糖硫酸鈉(DSS)灌胃造模成功后灌腸治療10 d，評估各組大鼠基礎狀況并計算疾病活動指數(DAI) ; 蘇木精-伊紅(HE) 染色后顯微鏡下觀察其病理變化并評分；ELISA法檢測大鼠結腸黏膜白細胞介素10(IL-10)，白細胞介素17(IL-17)表達水平。結果：組方中苦參、地榆、黃柏、白及4味中藥在三水平均可降低大鼠結腸黏膜促炎因子IL-17表達水平，提高抑炎因子IL-10表達；苦參、白及可明顯提高IL-10表達，降低IL-17含量，并且在1水平效應最高，但隨用量增加效應降低；地榆在2水平時，可明顯提高IL-10表達，在3水平時，可明顯降低IL-17含量；黃柏在2水平時，可明顯提高IL-10表達，在1水平時，可明顯降低IL-17含量；A、B、C、E、F、G、I組的IL-17含量均顯著低于模型組，IL-10表達顯著高于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)，D、H組IL-17含量低于模型組，IL-10表達高于模型組，但差異無顯著性(P>0.05)。潰結爽灌腸組中(A、B、C、E、F、G、I組)大鼠疾病活動指數(DAI)、結腸病理評分較模型組均有不同程度改善，結果與炎癥因子IL-17、IL-10表達水平變化一致。結論：潰結爽灌腸組方可以顯著改善UC大鼠癥狀、結腸組織學評分，其治療作用可能與降低大鼠結腸黏膜促炎因子IL-17表達、提高抑炎因子IL-10水平有關，從而維持腸道穩(wěn)態(tài)，促進腸道黏膜修復。

潰瘍性結腸炎;腸澼;久痢;休息痢;潰結爽;中藥灌腸;IL-10;IL-17;中藥組方

潰瘍性結腸炎(UC) 以遷延不愈、反復發(fā)作、病因復雜為特征，其發(fā)病可能涉及多因素、多環(huán)節(jié)綜合作用，臨床表現以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等直、結腸非特異性炎癥病變?yōu)橹?，不同患者間因病變部位、病變程度不同，表現不盡相同，重癥患者可同時伴有腸外多器官損害。[1]目前研究表明，細胞因子網絡失衡在UC腸道黏膜免疫反應的過程中具有重要作用。[2]我國的潰瘍性結腸炎患者多為輕度及中度，病變部位多在乙狀結腸和直腸(脾曲以遠)，因此臨床上灌腸等局部用藥對于該病的治療具有重要意義。[3-4]中藥灌腸治療作用直接、療效顯著，目前在國內廣泛應用。潰結爽方灌腸在臨床應用中每獲顯效。本研究通過正交試驗設計，觀察潰結爽方灌腸對UC模型大鼠疾病活動指數(DAI)、結腸病理評分、大鼠結腸黏膜白細胞介素10(IL-10)，白細胞介素17(IL-17)水平，探討其對UC大鼠炎癥水平的影響及療效機制，苦參、地榆、黃柏、白及4味中藥的之間的量效關系及其最佳配伍，為臨床中藥灌腸組方提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雄性wistar大鼠70只，7 ～ 8 周齡，體質量( 200±20) g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物合格證號: SCXK(冀) 2013-1-003，實驗動物合格證號:1610114。大鼠正常飲食，自由飲水，在室溫22℃下飼養(yǎng)，相對濕度40%～60%，正常光照。

1.1.2 藥物制備：潰結爽方(藥物組成：苦參，地榆，黃柏，白及)購于石家莊市中醫(yī)院中藥房，根據實驗方案用蒸餾水配制成不同濃度的混懸液，置于 4 ℃冰箱備用；葡聚糖硫酸鈉(DSS)，Sigma公司中國代理。

1.1.3 試劑與儀器：倒置顯微鏡：Olympus公司；酶標儀( BS-1101) ，南京德鐵實驗設備有限公司。大鼠IL-10Elisa試劑盒:上海恪敏生物科技有限公司(貨號：KB2735)；大鼠IL-17Elisa試劑盒：上海恪敏生物科技有限公司(貨號：KB2628)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模：基礎喂養(yǎng)適應性喂養(yǎng)1周后，隨機取6只為正常組(K組)，飲用蒸餾水。其余64只為模型復制組。用蒸餾水將DSS[4]溶解成濃度為5%的溶液，灌胃并自由飲用7 d，每日1次，每次4 mL，灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)。造模第7 d結束后從模型組隨機抽取4只處死，用以判斷模型復制情況，制作結腸病理切片觀察UC實驗模型大鼠是否建立。將造模成功的60只大鼠隨機分為10組，分別是從第A組到第I組、模型對照組(J組)，每組6只。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 大鼠給藥劑量：按臨床成人(人的體質量按70 kg算)用量的6.3倍，1次/d，每次2 mL，連續(xù)10 d。模型組及正常組給予相同計量0.9%氯化鈉溶液灌腸。治療組具體灌腸用藥如下：A組3.69 g/kg，B組6.48 g/kg，C組9.27 g/kg，D組6.93 g/kg，E組7.02 g/kg，F組8.19 g/kg，G組7.47 g/kg，H組8.64 g/kg，I組8.73 g/kg。

1.2.2.2 灌腸方法：用兒童肛軟管輕輕從大鼠肛門插入深度為8 cm， 每只大鼠灌腸2 mL，將各組藥液緩慢注入腸道，灌腸后大鼠倒掛安置10 min以延長灌腸液在腸道內的停留時間，從而達到保留灌腸的目的，之后自由飲食。療程；連續(xù) 10 d，1 次/d。療程結束后禁食不禁水1 d，之后處死動物取材備用。

1.2.2.3 具體用藥分組： 藥物，a=苦參， b=地榆，c=黃柏，d=白及。各因素取3水平，L1、L2、L3。a：苦參，L1=10 g，L2=20 g，L3=30 g；b：地榆，L1=15 g，L2=30 g，L3=45 g；c：黃柏，L1=6 g，L2=12 g，L3=18 g；d：白及，L1=10 g，L2=20 g，L3=30 g。不考慮各因子之間的的交互作用。

表頭設計：采用L9(34)正交表。

列號abcd因子1234

各試驗組方：

A.苦參10 g，地榆15 g，黃柏6 g，白及10 g。

B.苦參10 g，地榆30 g，黃柏12 g，白及20 g。

C.苦參10 g，地榆45 g，黃柏18 g，白及30 g。

D.苦參20 g，地榆15 g，黃柏12 g，白及30 g。

E.苦參20 g，地榆30 g，黃柏18 g，白及10 g。

F.苦參20 g，地榆45 g，黃柏6 g，白及20 g。

G.苦參30 g，地榆15 g，黃柏18 g，白及20 g。

H.苦參30 g，地榆30 g，黃柏6 g，白及30 g。

I.苦參30 g，地榆45 g，黃柏12 g，白及10 g。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 疾病活動指數：分別在造模結束后(第8 d)以及治療結束后(第18 d)對各組大鼠進行DAI評分。DAI評分=(大鼠大便性狀得分+大鼠體質量下降得分+大鼠便血得分)/3，具體標準見表1。

表1

DAI評分表

1.3.2 酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定腸黏膜IL-10、IL-17水平： 采用ELISA 法檢測UC大鼠腸組織 IL-10、IL-17含量。灌腸給藥10 d后，各組大鼠禁食水24 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肛門以上2 ～ 10 cm 結腸組織，生理鹽水沖洗后，濾紙吸干水分，分裝于凍存管中，冷凍于液氮罐中備檢。檢測時取出腸組織，各加5 倍的生理鹽水，超聲粉碎機勻漿，4 ℃，3 500 r / min 離心20 min，取上清，存放于1.5 mL EP管中。ELISA 法檢測UC 大鼠腸組織IL-10、IL-17含量的變化，檢測方法同說明書。采集實驗數據，計算樣本含量。

1.3.3 HE 染色觀測病理組織學情況并評分：取肛門以上2 ～ 10 cm 結腸組織，生理鹽水沖洗干凈，多聚甲醛固定，梯度脫水，石蠟包埋，常規(guī) HE染色，光鏡觀察，并由經驗豐富的病理教師對其進行量化雙盲評分。[4]光鏡下HE染色評分分數是由上皮細胞與炎細胞浸潤情況共同決定的，是2項分數之和。具體評分標準見表2。

表2

UC大鼠結腸病理組織學評分

2 結果

2.1 大鼠DAI評分 在實驗進程中正常組6只大鼠狀態(tài)良好，進食進水量正常，被毛緊密色白有光澤，糞便呈顆粒狀，無腹瀉，無血便，體質量逐漸增加。造模開始后，除正常組外，其他各組大鼠均有不同程度精神萎靡、肉眼血便、體質量下降，被毛稀松毛色泛黃無光，肛周污染嚴重。造模結束后，各模型組大鼠DAI評分顯著高于空白組，差異具有顯著性(P<0.05)。潰結爽灌腸治療開始后，A、B、C、I組大鼠出現不同程度好轉。治療第10 d，A、B、C、I組大鼠活動增加，飲食量及體質量增加，大便未見到黏液膿血，一般狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組大鼠。E、F、G組大鼠精神亦有所好轉，但形態(tài)較為消瘦，進食進水量較少，糞便接近成形，但仍偶可見肉眼血便，有輕微肛周污染。D、H組雖有所改善，但大鼠精神仍較差，體型瘦削，被毛無光澤，活動較少，大便稀溏，偶見黏液膿血，肛周不同程度污染。A、B、C、I、E、F、G組大鼠DAI評分較模型組明顯改善，差異具有顯著性(P<0.05)。D、H組雖有所改善，但差異無顯著性(P>0.05)。詳見表3。

表3

大鼠DAI評分

2.2 潰結爽方灌腸對UC 大鼠結腸組織中IL-17、IL-10水平的影響 大鼠造模成功后, 連續(xù)灌腸10 d，結腸組織中IL-10、IL-17水平結果如表4所示。UC 模型組結腸組織中IL-17水平均顯著高于正常組，IL-10顯著低于正常組，差異具有顯著性(P<0.05)。潰結爽灌腸方組結腸組織中A、B、C、E、F、G、I組的IL-17含量均顯著低于模型組，IL-10水平顯著高于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)。D、H組IL-17含量低于模型組，IL-10水平高于模型組，但差異無顯著性。潰結爽各劑量組呈現一定的量效關系，組方中苦參、地榆、黃柏、白及4味中藥在三水平均可降低大鼠結腸黏膜IL-17水平，提高IL-10含量?？鄥ⅰ准翱擅黠@提高IL-10表達，降低IL-17含量，并且在1水平效應最高，但隨用量增加效應降低。地榆在2水平時，可明顯提高IL-10表達；在3水平時，可明顯降低IL-17含量。黃柏在2水平時，可明顯提高IL-10表達；在1水平時，可明顯降低IL-17含量。詳見表5。

表4 潰結爽灌腸對UC大鼠結腸黏膜IL-10、IL-17水平的影響

注: 與模型組比較，△P< 0.05；與正常組比較，*P< 0.05

2.3 病理組織學情況 正常組(K組)大鼠結腸黏膜結構正常，腺體排列規(guī)整，杯狀細胞正常存在無減少；模型組(J組)大鼠結腸黏膜層可見大量浸潤的炎性細胞，隱窩結構消失，腺體破壞，杯狀細胞基本消失，部分黏膜上皮脫落，形態(tài)、結構被破壞；各治療組在潰結爽灌腸治療后與J組相比均有不同程度的改善，以炎癥表現為主，A、B、C、I 組大鼠在結腸黏膜可見少量炎性細胞浸潤，腺體排列較為整齊；E、F、G組大鼠炎性細胞浸潤到結腸黏膜下層甚至固有層，杯狀細胞減少；D、H組大鼠結腸腺體紊亂，可見分支現象，偶見肉芽組織增生。

潰結爽灌腸治療后，潰瘍性結腸炎模型組大鼠(J組)結腸病理組織學評分顯著高于正常組，差異具有顯著性(P<0.05)；潰結爽灌腸方A、B、C、E、F、G、I組的病理組織學評分均顯著低于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)；D、H組結腸病理組織學評分低于模型組，但差異無顯著性(P>0.05)。詳見表6。

表6 UC大鼠結腸病理組織學評分

3 討論

UC屬于中醫(yī)學“休息痢”“久痢”“大瘕泄”“腸澼”等范疇。[5]《素問·太陽陽明篇》云：“飲食不節(jié)，起居不時者，陰受之，陽受之則入六腑，陰受之則入五臟……入五臟則滿閉，下則飧瀉，久為腸澼?！痹摬“l(fā)病機制尚未完全明確，細胞因子網絡失衡在UC腸道黏膜免疫反應的過程中具有重要作用。目前研究表明，腸道黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，與肌體中促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的平衡狀態(tài)被打破有關。相關研究發(fā)現，炎性反應具有促進UC 發(fā)生發(fā)展的作用，UC 患者 IL -17 、腫瘤壞死因子-α( TNF-α) 等促炎因子水平明顯升高，IL-10 等抗炎因子水平明顯降低，促炎因子/抑炎因子失衡是導致腸道炎性反應重要原因之一。[6]

IL-17是由Th 17細胞分泌的一種強促炎因子，能夠激活并募集大量炎性細胞到肌體相應部位引發(fā)炎癥反應，參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，[7]并且IL-17的表達水平與潰瘍性結腸炎的炎性反應程度及疾病進展密切相關，有研究發(fā)現，[8]病情越嚴重的UC患者腸組織中IL-17 的表達水平越高，呈正相關。與IL-17生物學作用相反，IL-10能夠抑制致炎細胞因子的釋放從而抑制炎癥反應，是典型的抗炎與免疫抑制性細胞因子。IL-10的免疫調節(jié)活性基于其抑制細胞因子合成和抗原遞呈的能力。[9]研究顯示，活動期的UC患者 IL-10 的結腸組織含量明顯降低，緩解期有所上調，并且與病變范圍和病情嚴重程度呈負相關，所以 IL -10 在 UC 中可能是保護性因素。即使在正常飼養(yǎng)條件下(無特異性致病菌感染)IL -10的缺失能夠自發(fā)誘導多種自身免疫疾病的發(fā)生，如類似于克羅恩病的結腸炎，[10]慢性非感染性腸道炎癥[11]等。由此印證了IL-10 等炎癥因子在維持正常腸道黏膜免疫調節(jié)和炎癥反應平衡中發(fā)揮了重要作用。[12]

根據疾病嚴重程度，我國的UC患者多為輕度及中度，病變部位多在乙狀結腸和直腸(脾曲以遠)，所以臨床上灌腸等局部用藥對于該病的治療具有重要意義，[4]并在指南中得到肯定。中藥灌腸可使藥物與病變部位直接接觸，藥物直達病所，使之充分接觸病灶，有效成分直接通過腸道黏膜吸收，提高了病變部位的血藥濃度，使藥物迅速被吸收，改善組織營養(yǎng)和血供，修復腸道潰瘍面，促進潰瘍愈合，充分發(fā)揮藥物的局部治療作用；同時由于避免了肝臟的首過消除效應，減少了藥物在肝臟及胃腸多種酶對藥物的破壞，生物利用度得到了充分發(fā)揮，且無明顯毒副作用，是臨床常用的重要治療方法之一。因此，尋找更加有效的中藥灌腸方具有重要的臨床意義。

筆者曾對146首中藥治療UC灌腸方藥物進行統計，根據每味藥物的應用頻數，依次為：苦參、地榆、黃柏、白及、三七、大黃、五倍子、明礬、馬齒莧、黃連、槐花、兒茶等。此次統計與潰結爽組方相一致。潰結爽灌腸方(黃柏，苦參，地榆，白及)以清熱燥濕、涼血解毒、止血生肌為組方原則，在其長期臨床應用中，療效明顯。黃柏苦寒，入腎、膀胱、大腸經，清熱燥濕，瀉火解毒，現代藥理研究其具有抗菌抑菌，改善創(chuàng)面微循環(huán)，促進潰瘍愈合的作用?？鄥⒖嗪?入大腸、小腸、胃、肝、心經，主治熱毒血痢,腸風下血, 赤白帶下等，葉天士稱其“治痢極效, 百發(fā)百中之藥”，其同樣可以抗菌殺蟲，抗病毒，抗炎，調節(jié)免疫。地榆苦酸澀，微寒，歸大腸、肝經,功能清熱解毒、涼血止血，《藥性論》謂：“止血痢蝕膿?！币志寡椎耐瑫r還可止瀉止血。白及苦甘澀、微寒,入肺經，功擅止血、消腫,生肌、斂瘡, 其可止血，促進潰瘍愈合。

臨床有1 d灌腸2次，甚至1次灌2付藥，亦取得非常滿意的療效。啟發(fā)筆者可以針對患者病情，靈活調整藥量來提高藥效。中醫(yī)不傳之秘在用量，所以采用正交試驗設計處理這種多因素多水平實驗，通過綜合比較和方差分析，對苦參、地榆、黃柏、白及4味中藥的單因素效應進行分析，在探尋其療效機制的同時，并確定他們之間的量效關系及其最佳配伍，為臨床中藥灌腸組方提供依據。

本研究結果顯示，模型組大鼠結腸黏膜組織中IL-17水平顯著高于正常組(P<0.05)，IL-10表達量明顯低于正常組(P<0.05)；潰結爽灌腸組A、B、C、E、F、G、I組大鼠結腸組織中IL-17水平較模型組明顯降低(P<0.05), IL-10表達量均明顯高于模型組(P<0.05),差異具有顯著性。研究初步證實潰結爽灌腸可降低UC結腸組織中促炎因子IL-17的水平，提高抑炎因子IL-10含量，減輕肌體免疫反應，改善肌體炎癥反應狀態(tài)。造模后，大鼠出現不同程度精神倦怠，體質量下降，飲食量減少，大便稀溏，甚至排黏液膿血，肛周污染；各劑量組潰結爽灌腸過程中大鼠外觀體征均有不同程度好轉。A、B、C、I組大鼠改善明顯，精神好轉，體質量、進食進水量增加，皮毛、排便情況等較前改善。病理組織學觀察結果顯示，模型組大鼠結腸黏膜炎性細胞浸潤，杯狀細胞減少或消失，腺體破壞，被浸潤的炎癥細胞替代，個別黏膜層明顯變薄，個別肌層組織炎癥較重，失去正常結構的程度，潰結爽不同劑量組大鼠的病變都較前減輕，其中以A、B、C、I組大鼠改善明顯。此外，IL-17 、IL-10與UC大鼠DAI評分、病理組織學評分有明顯的相關性，結果一致。說明潰結爽灌腸對 UC 模型大鼠具有較顯著的治療作用。

本研究結果顯示，潰結爽灌腸后大鼠結腸黏膜促炎因子IL-17的含量明顯降低，而抑炎因子IL-10的水平上調，并且DAI評分及結腸組織病理學表現較模型組也有所改善，說明潰結爽能調節(jié)UC大鼠抗炎和抑炎因子的失衡，使其恢復平衡，抑制或緩解結腸黏膜炎癥反應，從而使受損腸道黏膜得到修復和一定程度的愈合。另外，實驗結果同時提示，結腸組織炎癥因子表達的失衡情況與結腸的損傷程度具有一致性，這從另一角度印證了潰結爽治療 UC 的機制可能與其對炎癥因子的調控作用有關。維持或調節(jié)促炎因子與抗炎因子之間的平衡，恢復 UC 大鼠免疫功能，這可能是潰結爽治療 UC 免疫機制之一，也可能成為今后 UC 治療的新策略和新方法。但中藥復方作用機制復雜，其相關機理還有待進一步的研究。

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(2017-06-04 收稿)

*河北省中醫(yī)藥管理局科學技術研究計劃項目：No.2016102

R285.5

A

1007-5615(2017)04-0037-05

方 藥 研 究