希望III號液改善臭氧加重二乙基亞硝胺致肝損傷的藥效作用研究*

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

劉琳琳 張 睿 彭金娥 趙 欣△ 蔡大勇△ 王玥琦(北京 100029)

希望III號液改善臭氧加重二乙基亞硝胺致肝損傷的藥效作用研究*

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

劉琳琳 張 睿 彭金娥 趙 欣△蔡大勇△王玥琦(北京 100029)

目的：探討希望III號液對臭氧加重二乙基亞硝胺(DEN)致大鼠肝損傷的治療作用。方法：48只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、維生素E組、希望III號液低、中、高劑量組，每組8只。對照組吸入新鮮空氣，腹腔注射(ip)生理鹽水50 mg/kg；各造模組腹腔注射DEN 50 mg/kg，每周2次，同時吸入臭氧(0.65±0.12) ppm, 4 h/d，各組于造模2周后開始給藥，其中對照組和模型組每天灌胃(ig)飲用水，各給藥組同步灌胃維生素E(13.5 mg/kg)與希望III號液(45、90、180 mg/kg)治療。給藥8周后取大鼠血清和肝臟組織，檢測大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、堿性磷酸酶(ALP)和丙二醛(MDA)、分型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD、T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量；肝臟組織常規(guī)HE染色、Masson染色觀察組織形態(tài)；形態(tài)劑量肝細胞體積構(gòu)成比、肝膠原纖維體積比。結(jié)果： 模型組大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)， CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量降低(P<0.01)，肝細胞體積構(gòu)成比增大(P<0.01)，膠原纖維沉積增加(P<0.01)。希望III號液能抑制大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)，回升CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量(P<0.01)，回降肝細胞體積構(gòu)成比和膠原纖維沉積增加(P<0.01)。 結(jié)論：希望III號液可以改善肝損傷狀態(tài)下肝臟功能，調(diào)節(jié)肌體氧化應(yīng)激過程，延緩肝臟纖維化進程，對臭氧加重DEN致大鼠肝損傷有保護作用。

肝損傷；希望III號液；臭氧；二乙基亞硝胺；滋陰理氣

《素問·六節(jié)藏象論》 曰：“ 天食人以五氣, 地食人以五味”，論及了環(huán)境與人之間的密切關(guān)系，指出天地對人的關(guān)愛,通過五氣和五味體現(xiàn)出來。[1]作為亞硝胺類化合物的前體物質(zhì)，亞硝酸鹽在自然界中廣泛存在，食物在加工過程中易轉(zhuǎn)化成亞硝胺和其他N-亞硝基化合物，危害人體健康。[2]亞硝胺類化合物對肝臟損傷的研究已較為成熟，然而，人生活在自然環(huán)境中，受多元因素的影響，當(dāng)前，我國近地表臭氧濃度受工業(yè)化進程的影響逐年攀升，大氣臭氧污染日益嚴重，在人口密集的城市群地區(qū)情況尤為嚴重。[3]研究旨在探討希望III號液對臭氧加重二乙基亞硝胺(DEN)致大鼠肝損傷的治療作用。希望III號液主要由枸杞子和佛手組成，枸杞子補腎益精、養(yǎng)肝明目、補血安神，佛手理氣化痰、舒肝健胃，二者合用，具有滋陰理氣的功效。[4-6]

1 材料

1.1 動物 Wistar大鼠〔北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司， SCXK(京)2012-0001〕，雄性，48只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g。

1.2 藥品和試劑 希望III號液(主要由枸杞子和佛手組成， 生藥飲片均購自北京同仁堂藥店，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)中心配制)；維生素E軟膠囊，每粒100 mg，(天津市中央藥業(yè)有限公司，批號：160410)。生化試劑盒ALT、AST、GST、ALP、MDA、CuZn-SOD、T-SOD、GSH-Px購自南京建成生物工程研究所(批號：20160704)。

1.3 儀器 臭氧發(fā)生器(山東精工好醫(yī)生儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，熱電上海儀器有限公司)；電子恒溫水浴箱(北京長風(fēng)儀器儀表公司)；高速臺式離心機(GT16-3型，北京時代北利離心機有限公司)；旋渦混合器(QL-901，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；石蠟包埋機(SleeMPS/P2型，德國SLEE)；石蠟切片機(RM2245，德國Leica)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及取材 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按體質(zhì)量隨機分為對照組、模型組、維生素E組、希望III號液低、中、高劑量組，每組8只。對照組吸入新鮮空氣，腹腔注射(ip)生理鹽水50 mg/kg；各造模組腹腔注射DEN 50 mg/kg，每周2次，同時吸入臭氧(0.65±0.12)ppm, 4 h/d，染毒柜與臭氧發(fā)生器連接，參照國家標(biāo)準(zhǔn)(靛藍二磺酸鈉分光光度法)實時監(jiān)測染毒柜內(nèi)的臭氧濃度，2周后結(jié)束造模，開始給藥，其中對照組和模型組每天灌胃(ig)飲用水，各給藥組同步灌胃維生素E(13.5 mg/kg)與希望III號液(45、90、180 mg/kg)治療。給藥8周后取材，腹主動脈取血，分離取血清；取肝臟組織于中性福爾馬林中固定48 h。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 血清生化指標(biāo)檢測：腹主動脈取血，分離血清，按試劑盒說明書檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、堿性磷酸酶(ALP)、丙二醛(MDA)、分型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD、T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平。

2.2.2 組織病理學(xué)形態(tài)觀察：取肝臟組織于中性福爾馬林中固定48 h，換PBS，將肝臟組織修成1 cm×1 cm的方塊，梯度酒精脫水、二甲苯固定、浸蠟之后，將組織包埋成蠟塊，切片機3～4 μm切片，HE染色、Masson染色進行組織形態(tài)學(xué)觀察，對比分析各組大鼠肝臟組織病理變化。

2.2.3 形態(tài)計量：將病理切片在40×10倍數(shù)下進行掃描，保存病理圖片。肝細胞體積構(gòu)成比、肝膠原纖維體積比使用Image-Pro Plus軟件進行分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS22軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，2組數(shù)據(jù)采用t檢驗，P<0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 希望III號液改善大鼠肝臟功能 與對照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、GST、ALP含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，維生素E組和希望III號液低、中、高劑量組ALT、AST、GST、ALP含量顯著降低(P<0.01)。結(jié)果詳見表1。

組別劑量(mg/kg)ALT AST GSTALP對照組/538±060740±06928491±18201773±187模型組/1452±149??1249±098??47866±3301??4253±314??維生素E組135720±081##935±038##35391±2540##2882±234##低劑量組450735±075##872±056##31718±2338##2610±232##中劑量組900656±053##821±068##30309±1952##2396±190##高劑量組1800648±054##844±056##31003±2351##2291±225##

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.2 希望III號液改善大鼠氧化應(yīng)激功能 與對照組相比，模型組大鼠血清MDA含量升高(P<0.01)，CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量降低(P<0.01)；與模型組相比，維生素E組和希望III號液低、中、高劑量組MDA含量降低(P<0.01)，CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量回升(P<0.01)。結(jié)果詳見表2。

3.3 希望III號液改善大鼠組織形態(tài)

組別劑量(mg/kg)MDA(nmol/mgprot)CuZn-SOD(U/mgprot)T-SOD(U/mgprot)GSH-Px(活力單位)對照組/968±09217185±116923361±152048318±3107模型組/2242±169??11441±908??17870±1586??35896±2312??維生素E組1351510±097##13388±1028##21081±1642##41091±3264##低劑量組4501327±145##14552±953##21162±1333##43269±3237##中劑量組9001429±142##14932±1264##21337±1472##44309±3728##高劑量組18001375±104##15194±1276##21657±1659##43971±2971##

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.3.1 肝細胞體積比變化情況：對照組大鼠肝細胞大小適中，胞核染色均勻，核膜完整。模型組肝細胞數(shù)量減少，肝細胞代償性肥大，可見纖維增生，匯管區(qū)有出血點，淋巴細胞顯著聚集；膽管增生，肝索排列紊亂，可見出血灶；核固縮，雙核細胞增多，胞漿出現(xiàn)脂肪樣變性。結(jié)果見圖 1。形態(tài)計量結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組肝細胞體積比升高(P<0.01)；與模型組相比，維生素E組和希望III號液低、中、高劑量組肝細胞體積比回降(P<0.01)。結(jié)果詳見表3。

3.3.2 膠原纖維沉積變化情況：對照組大鼠膠原纖維含量較少，在匯管區(qū)和中央靜脈周圍，分布規(guī)則。模型組膠原纖維含量增加，由匯管區(qū)向肝小葉延伸。結(jié)果見圖 2。形態(tài)計量結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組膠原纖維體積比升高(P<0.01)；與模型組相比，維生素E組和希望III號液低、中、高劑量組膠原纖維胞體積比回降(P<0.01)。結(jié)果詳見表3。

圖1 各組肝細胞體積比情況(HE，×400)

圖2 各組肝臟膠原纖維沉積情況(Masson，×400)

表3

希望III號液改善肝細胞體積比和膠原纖維體積比 ±s,n=8)

注：與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01

4 討論

《素問· 六節(jié)臟象論》說:“五氣入鼻, 藏于心肺，上使五色修明，音聲能彰；五味入口, 藏于腸胃, 味有所藏, 以養(yǎng)五氣，氣和而生，津液相成，神乃自生?！倍斓貙θ说年P(guān)愛不是無條件的，而是以順應(yīng)四時為規(guī)則的，當(dāng)平衡被打破，濁毒傷人，肌體氣血陰陽失調(diào)，則變生各種疾患。[1]

亞硝胺是世界公認的三大致癌物質(zhì)之一,可使多種動物的多種器官組織產(chǎn)生腫瘤，1次大劑量或多次少量長期攝入均可致癌。[7]亞硝酸鹽是亞硝胺類化合物的前體物質(zhì)，廣泛存在于自然界環(huán)境中。根據(jù)目前已有的結(jié)果，魚類、肉類、蔬菜類和啤酒類等食品中含有較多的亞硝胺類化合物，[8]在煙草、化妝品、飲用水消毒副產(chǎn)物、橡膠制品中也含有較多的亞硝胺類物質(zhì)，[9-13]這些物質(zhì)可經(jīng)呼吸道、皮膚、消化道等多種途徑直接攝入人體。關(guān)于DEN造成肝臟損傷筆者已經(jīng)有較為明確的認識，[17]而近年來，地球?qū)α鲗哟髿馄骄粞鯘舛戎鹉暝黾?，工業(yè)革命前對流層大氣平均濃度為38 ppb，[14]2000年已經(jīng)上升到50 ppb，預(yù)計到2050年，近地表的平均濃度將增加至70 ppb,明顯高于傷害臨界值。[15]隨著工業(yè)化進程的加快，我國近地表臭氧濃度也明顯增加，其中長江三角洲地區(qū)臭氧濃度最大值接近160 ppb。[3]針對日益增加的臭氧濃度污染，越來越多的科學(xué)家和公眾開始密切關(guān)注臭氧危害，科學(xué)家們從事了大量的科學(xué)研究。[16]本實驗旨在探究臭氧對DEN造成的肝臟損傷的加重作用及希望III號液對肝臟的保護作用。

自由基能氧化細胞膜上脂質(zhì)成分、組織或酶中的蛋白質(zhì)以及糖類，導(dǎo)致過氧化損傷。給予DEN后，動物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激壓力，同時也導(dǎo)致抗氧化劑的消耗，加強了對細胞的損傷；臭氧作為外源性刺激物，可刺激肌體產(chǎn)生自由基，加強DEN造成的肌體過氧化損傷。枸杞子味甘，性平，入肝、腎二經(jīng)?，F(xiàn)代研究表明，枸杞子中含多種營養(yǎng)成分和微量元素，其中主要有效成分枸杞子多糖在肌體免疫、降血糖、降血脂、抗衰老、抗疫勞、抗腫瘤、保肝及生殖系統(tǒng)保護等方面有藥理作用。[4-5]佛手性味辛、苦、溫，入肝、脾、胃、肺經(jīng)?！侗静荼阕x》言其“理氣快膈，惟肝脾氣滯者宜之”。[6，18]現(xiàn)代研究表明佛手具有止咳平喘祛痰、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗炎等作用。

生化指標(biāo)AST、ALT、ALP、GST ,可以反映肝細胞受損的嚴重程度。[19-20]在肝細胞受到損害后，細胞變性、壞死，細胞膜破碎或細胞膜的通透性增加，肝細胞中所含的 ALT 和 AST 就會被釋放到血液中，使血中 ALT、AST 活性增加。[21-22]GST與肝臟解毒有關(guān),當(dāng)肝細胞受損害時,常很早釋放到血中,血中GST的升高常常早于ALT和AST,因而GST的升高可作為肝臟損傷的敏感指標(biāo)。[23]研究表明，氧化應(yīng)激不僅是臭氧損傷的重要機制之一，同時也是導(dǎo)致亞硝胺損傷的重要機制。[24]肌體主要抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，參與清除活性氧自由基，抗氧化儲備。[25]丙二醛(MDA)是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終分解產(chǎn)物,對細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，蛋白質(zhì)以及核酸造成直接損傷，反映細胞的脂質(zhì)過氧化程度。[26]

實驗采用DEN和臭氧制備肝損傷模型，結(jié)果顯示模型組大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)， CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量降低(P<0.01)，肝細胞體積構(gòu)成比增大(P<0.01)，膠原纖維沉積增加(P<0.01)。希望III號液能抑制大鼠血清ALT、AST、GST、ALP、MDA含量升高(P<0.01)，回升CuZn-SOD、T-SOD和GSH-Px含量(P<0.01)，回降肝細胞體積構(gòu)成比和膠原纖維沉積增加(P<0.01)。證實希望III號液可以改善肝損傷狀態(tài)下肝臟功能，調(diào)節(jié)肌體氧化應(yīng)激過程，延緩肝臟纖維化進程，對臭氧加重DEN導(dǎo)致大鼠肝損傷具有保護作用。

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(2017-07-10 收稿)

*北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團隊基金資助項目：No.2011-CXD-04

王玥琦，女，博士研究生導(dǎo)師，教授。

R285.5

A

1007-5615(2017)04-0042-05

△中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所(北京100193)