高敏HCV RNA檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用

劉娜 李春霞 東冰 周路路 張瑞芹 徐光華

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一［1］。2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）估計全世界約有7 100 萬慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C，CHC）患者（全球流行率：1%）［1-2］；2006年全國血清流行病學(xué)調(diào)查顯示我國1～59 歲人群抗-HCV 流行率為0.43%［3］。HCV 感染具有隱匿性，且高度慢性化（慢性化率為55%～85%［3］），20%～30%的CHC 患者會在20～30年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，而發(fā)展為肝硬化的患者肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的年發(fā)生率為2%～4%［4］。基于此，WHO 發(fā)布了病毒性肝炎的全球戰(zhàn)略，即在2030年之前將丙型肝炎的新發(fā)感染率下降90%，死亡率下降65%；要求90%的感染者得到診斷，80%被確診患者得到治療［5］。然而在目前7 100 萬CHC 患者中，只有1 400 萬人（20%）被診斷（70%的差距）；在1 400 萬被診斷的患者中，只有110 萬人（7%）開始接受治療（73%的差距）［6］。隨著2014年sofosbuvir（SOF）的上市，丙肝成為一種可以治愈的疾?。?］。故現(xiàn)階段，早篩查、早診斷對于丙肝的防控尤為重要。目前，國內(nèi)外主要以抗-HCV 的篩查試驗和HCV RNA 的確認(rèn)試驗來診斷HCV 感染?？?HCV 檢測窗口期較長（8～12 周的窗口期，部分患者甚至可長達5～8個月［8］）、無法區(qū)分既往感染與現(xiàn)癥感染，且易出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果；而國內(nèi)常規(guī)的PCR 技術(shù)雖能區(qū)分既往感染與現(xiàn)癥感染，但由于最低檢測限為500～1 000 IU/mL，故不能滿足臨床的需求。高敏HCV RNA 檢測因其靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、攜帶污染低、檢測反應(yīng)時間短、自動化程度高等優(yōu)點，可實現(xiàn)對HCV 感染的精準(zhǔn)診治，因此具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

1 高敏HCV RNA 檢測技術(shù)的概述

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time，PCR）融匯了PCR 高敏感性、探針雜交高特異性和光譜檢測高精確性等技術(shù)優(yōu)點，被認(rèn)為是檢測HCV RNA 定量的標(biāo)準(zhǔn)方法［9］。市面上現(xiàn)有多種FQ-PCR 檢測技術(shù)。國內(nèi)傳統(tǒng)的非高敏FQ-PCR檢測技術(shù)由于線性范圍窄、靈敏度低，最低檢測限為500～1 000 IU/mL，在HCV RNA 載量較低時往往難以檢出，特別是不能檢測低于檢測下限（limit of detection，LOD）的陽性樣本，故無法滿足臨床檢測需求。高敏PCR 檢測技術(shù)應(yīng)用全自動核酸提純及熒光PCR 分析系統(tǒng)的HCV RNA 定量檢測性能，實現(xiàn)了提取和擴增的全程自動化，在提取試劑中加入內(nèi)標(biāo)，可與樣本同時進行提取和擴增，實現(xiàn)全程監(jiān)控實驗進程，有效地避免了假陰性結(jié)果；利用磁珠法提取可增加反應(yīng)體積；對擴增體系進行了優(yōu)化（見圖1所示）。且其檢測結(jié)果采用國際單位（IU）/mL 表示（WH0 制定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)）［10］。目前已在臨床廣泛應(yīng)用的2 種高敏HCV RNA 檢測方法分別是雅培Abbott RealTime（ART）m2000 PCR 儀（線性范圍：12～1×108IU/mL）和羅氏 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan2.0（CAP/CTM2）全自動病毒載量儀（線性范圍：15～1×108IU/mL）［11］，均可實現(xiàn)較低水平的LOD。高敏HCV RNA 的檢測結(jié)果可以用4 種不同的方式來報告：①目標(biāo)未檢測出：HCV 的Ct 值未達到含量測定限值或者未檢出HCV 的Ct 值，報告結(jié)果有時也表示為“target not detected”或“undetectable”；②可檢測/不可量化：可檢測到HCV RNA，但計算的IU/mL 值低于測定的定量下限（lower limit of quantification，LLOQ），報告結(jié)果為HCV RNA＜12 IU/mL （ART） 或 ＜15 IU/mL （CAP/CTM2）；③具體特定值：在相應(yīng)的測定線性范圍內(nèi)，即≥LLOQ 且≤定量上限（upper limit of quantitation，ULOQ），報告結(jié)果為具體的數(shù)值的IU/mL；④＞ULOQ，計算結(jié)果超過了測定的線性范圍，報 告 結(jié)果為HCV RNA＞108IU/mL（ART 或CAP/CTM2）；如果希望得到定量結(jié)果，原始的標(biāo)本需要按要求稀釋后重復(fù)測試。谷金蓮等［12］通過比較國產(chǎn)試劑與羅氏進口試劑對HCV RNA 的檢測性能，發(fā)現(xiàn)3 種國產(chǎn)HCV RNA 定量試劑的陽性檢出率11.51%～14.80%，均顯著低于進口試劑的陽性檢出率（26.97%），而國產(chǎn)試劑檢測漏檢的樣本主要分布在HCV RNA＜50 IU/mL 的檢測下限中。目前國內(nèi)外指南均建議應(yīng)用采用靈敏度和精確度更高的FQ-PCR 方法定量檢測HCV RNA［3，10，13-14］。

2 高敏HCV RNA 檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)診斷方法的不斷革新，近年來，高敏HCV RNA 檢測技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于臨床中，且臨床應(yīng)用優(yōu)勢越來越明顯。

圖1 磁珠分離技術(shù)Figure 1 Magnetic bead separation technology

2.1 在急慢性丙型肝炎診斷中的應(yīng)用

抗-HCV 在大多丙型肝炎患者中均可測定，但由于窗口期較長，一般為8～12 周的部分患者甚至可長達5～8 個月［8］，故對于急性丙型肝炎（acute hepatitis C，AHC）患者可出現(xiàn)抗-HCV 陰性［3］，不能完全滿足早期篩查的要求。而血清中HCV RNA 出現(xiàn)較早，暴露HCV 后約1 周在外周血中即可檢測到HCV RNA［15］；且由于抗-HCV 僅反映HCV 是否感染的主要指標(biāo)，不能區(qū)分HCV 是現(xiàn)癥感染還是已被清除，特別對于18 個月以下的嬰幼兒，只有通過檢測HCV RNA，才能明確感染的狀態(tài)，因為經(jīng)過胎盤的母體抗-HCV 可在嬰幼兒血液里保持18 個月［10］。高敏HCV RNA 檢測技術(shù)不但可以縮短檢測窗口期，而且對于抗-HCV陽性的嬰幼兒可實現(xiàn)精準(zhǔn)診斷。HCV 感染的精準(zhǔn)篩查非常重要，不僅可以降低傳播率，而且對于AHC 患者早期抗病毒治療可以取得更高的應(yīng)答率［16］。研究證實，對于AHC 患者早期應(yīng)用DAAs 治療后不僅可以改善臨床結(jié)局，而且與推遲治療到CHC 階段相比，具有很高的成本效益［17］?？?HCV 由于本身技術(shù)的局限性在臨床中易出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果（重組蛋白純度不足、骨髓瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎等患者可出現(xiàn)抗HCV 假陽性［18-19］，而血液透析和免疫功能缺陷或合并HIV 感染者可出現(xiàn)抗-HCV 假陰性［20］）；盡管第三代ELISA 試劑的特異性已達99%［21］，但在低危險人群的假陽性率高達15%～60%（平均35%）［22］。目前大多數(shù)實驗室對于丙肝的篩查采用兩步方法，第一步做抗-HCV 檢查，當(dāng)抗體陽性后第二步做HCV RNA 檢測，故易出現(xiàn)漏診，特別是那些高感染風(fēng)險（注射吸毒者、艾滋病毒抗體陽性的男男性行為無保護［13］）以及抗-HCV 高流行地區(qū)，建議有條件盡可能行高敏HCV RNA 檢測［23］；對于那些免疫功能低下的抗-HCV 陰性者，也應(yīng)積極進行HCV RNA 檢測［24］。早在2009年美國肝臟病研究協(xié)會（AASLD）就指出在高危人群中應(yīng)用敏感的方法篩查和診斷丙型肝炎病毒感染的重要性［20］。研究表明，感染基因型1 和6 的患者HCV RNA 往往高于基因型2 或3的患者［25］，故對于基因型2 或3 的低病毒載量患者更建議應(yīng)用高敏HCV RNA 檢測技術(shù)進行評估，因為低水平病毒復(fù)制仍可能引起肝臟的持續(xù)損傷，進而引起肝纖維化、肝硬化甚至HCC，常規(guī)的PCR 技術(shù)就可能使患者錯過最佳的抗病毒治療時機。此外，2015年國家開始對抗-HCV 陰性獻血員篩查HCV RNA，經(jīng)輸血和血制品傳播已很少發(fā)生，而高敏的HCV RNA 檢測仍可發(fā)現(xiàn)隱匿性感染病例。因此，應(yīng)用高敏HCV RNA 檢測技術(shù)是精準(zhǔn)診斷急慢性丙型肝炎的重要保障。

2.2 在判定抗-HCV 灰區(qū)標(biāo)本是否感染中的應(yīng)用

在抗-HCV 免疫測定中，結(jié)果判斷是根據(jù)被測物的吸光度值（Signal）同診斷界值（Cutoff，CO）的比值（Signal-to-Cutoff，S/CO）來決定的。由于檢測技術(shù)本身問題，CO 值臨界范圍內(nèi)的測定結(jié)果難以明確判斷是陰性還是陽性，被界定為灰區(qū)。ELISA 方法檢測抗-HCV 一般將S/CO≥1，判斷為反應(yīng)陽性；S/CO＜1，則判斷為陰性［26］。閔少菊等人［27］對183 例處于ELISA 灰區(qū)（0.7≤S/CO＜1）的標(biāo)本進行了HCV RNA 檢測（國產(chǎn)達安試劑），3 例HCV RNA 陽性。而第三代免疫分析儀Architect i2000化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）方法檢測抗-HCV一般將S/CO＞5，判斷為反應(yīng)陽性；S/CO＜1，則判斷為陰性。有人將處于Architect i2000 檢測灰區(qū)的標(biāo)本（1≤S/CO＜5.2）進一步行高敏HCV RNA（LOD≤30 IU/mL），陽性率為0.75%（5/665）［28］；杜麗枝等人［29］也將Architect i2000 檢測抗-HCV 陽性灰區(qū)標(biāo)本（1≤S/CO≤5）進一步行高敏HCV RNA 檢測（LOD≤25 IU/mL），陽性率為0?？梢姡捎诿庖邷y定技術(shù)本身的局限性，抗-HCV 的假陽性結(jié)果在一定程度上會給受檢者帶來不必要的就醫(yī)和心理壓力。此外，由于灰區(qū)臨界值設(shè)置尚未統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化，合格血液有可能被判定為抗-HCV 陽性而報廢處理，不利于血液的合理、有效地利用；不合格的血液有可能被判定為抗-HCV 陰性造成受血者有輸血傳播性感染（TTI）的風(fēng)險?？梢?，確定合適的診斷界值對減少假陽性和假陰性的出現(xiàn)均有重要意義，若誤診會加重患者的心理負(fù)擔(dān)，甚至引起醫(yī)療糾紛。因此，高敏HCV RNA 檢測為精準(zhǔn)判定灰區(qū)樣本是否存在HCV 感染提供了有效依據(jù)。

2.3 在抗病毒應(yīng)答及停藥中的應(yīng)用

有效抗病毒治療不一定會造成抗-HCV 陰轉(zhuǎn)，即使感染治愈后抗-HCV 可持續(xù)陽性。HCV RNA定量檢測適用于HCV 現(xiàn)癥感染的確認(rèn)、抗病毒治療前基線病毒載量分析，以及抗病毒治療過程中及治療結(jié)束后的應(yīng)答評估［3］。精準(zhǔn)的HCV RNA定量檢測對HCV 感染的治療意義重大，有助于預(yù)測治療效果、判斷停藥時機以及評估治療結(jié)局。在干擾素治療時代，特別強調(diào)應(yīng)答指導(dǎo)治療（response-guided treatment，RGT）的概念，即在治療前及治療4、12 和24 周應(yīng)采用高敏FQ-PCR 方法監(jiān)測HCV RNA，根據(jù)治療期間HCV RNA 的水平早期評估對干擾素的應(yīng)答情況，以確定治療的療程［30］。對于實現(xiàn)快速病毒學(xué)應(yīng)答（rapid virological response，RVR）的患者考慮療程可縮短為24 周（基因1 型或4 型）或12～16 周（基因2 型或3型）［3，31-32］。RGT 有助于提高Peg-INF 的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（sustained virological response，SVR）率和降低不良反應(yīng)率［14］，還可以減輕患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。國產(chǎn)試劑檢測的靈敏度較低，可能會導(dǎo)致一些部分早期病毒學(xué)應(yīng)答（partial EVR，pEVR））患者被誤判為完全早期病毒學(xué)應(yīng)答（complete EVR，cEVR），未將療程再延長24 周，可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)率升高。王劍等人［33］通過對比國產(chǎn)試劑與Roche COBAS TaqMan 試劑的Peg-IFN/利巴韋林（RBV）的應(yīng)答率，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)試劑判定RVR 的假陰性率為37.3%（28/75），EVR 的假陰性率為20.8%（5/24）。在DAAs 治療時代，精準(zhǔn)檢測HCV RNA 水平對個體化診療方案的制定也有一定的意義。對于未治療、非肝硬化、基因1 型的患者，應(yīng)用ledipasvir（LDV）和sofosbuvir（SOF）治療時只要基線HCVRNA 水平＜6.8log10IU/mL，就可將治療時間從12 周縮短到8周［34］?？s短療程后可降低高成本的治療費用、防止DAAs 的副作用、減少藥物的相互作用（drug-drug interactions，DDIs）［11］。由于大多數(shù)患者應(yīng)用DAAs治療后，早期就可獲得病毒學(xué)應(yīng)答，但在治療第2周、第4 周和治療結(jié)束時檢測高敏HCV RNA 水平，可以實時掌握患者的依從性和治療效果［14］。有研究發(fā)現(xiàn)SOF/RBV 治療基因型1 的CHC 中，治療2周時，復(fù)發(fā)患者與SVR 患者HCV RNA 水平差異最大［35］。因此精準(zhǔn)的掌握HCV RNA 定量可預(yù)測患者SVR 率，識別易治和難治的患者，特別在某些難治療的患者群中，包括晚期肝硬化、HCV 基因型3的患者，治療早期HCV RNA 的變化是治療結(jié)果的有效預(yù)測因素［36-38］。判斷抗HCV 治愈的標(biāo)準(zhǔn)是通過SVR 來判斷，被定義為在治療結(jié)束后12 周（SVR12）或24 周（SVR24）中檢測不到HCV RNA，LOD 需≤15 IU/mL［16］，因為超過99%的SVR 患者不會復(fù)發(fā)［39］。有研究報到在治療結(jié)束時，經(jīng)常規(guī)PCR（檢測限為50～100 IU/mL）檢測陰性的血清標(biāo)本中，應(yīng)用雅培ART 技術(shù)檢測高敏HCV RNA 后13.8%（28/202）為陽性，殊不知這種微量殘留的病毒血癥對治療后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)有很高的預(yù)測作用［40］。

總之，國內(nèi)傳統(tǒng)的非高敏FQ-PCR 檢測技術(shù)HCV RNA 定量已逐漸不能滿足臨床的需求，而高敏HCV RNA 檢可精準(zhǔn)評估HCV RNA 水平，是HCV 感染者個體化診療的基石，是實現(xiàn)HCV 感染診療并重、精準(zhǔn)治愈的重要工具，也符合國內(nèi)外指南對HCV RNA 定量檢測的要求，故具有較高的臨床應(yīng)用價值，值得廣泛推廣應(yīng)用。