miR-122、miR-150在隱匿性乙型肝炎鑒別診斷中的研究

馬青松 張云芬

有研究表明當(dāng)出現(xiàn)病毒變異或稀有亞型乙型肝炎（hepatitis B virus，HBV）感染時，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）檢測結(jié)果為陰性；還有一部分患者血清HBsAg 檢測陰性，但血清或者肝臟組織中HBV DNA 檢測陽性，此部分患者被稱為隱匿性感染［1］。隱匿性乙型肝炎臨床一般無法檢測到血清HbsAg，但病毒本身仍處于低復(fù)制活動狀態(tài)，仍具有一定傳染性，增加患者乙肝復(fù)發(fā)機(jī)率，加速肝臟疾病進(jìn)展，并使其成為威脅輸血安全、器官移植安全的巨大隱患［2］。據(jù)報道中國無償獻(xiàn)血人群中隱匿感染率約為0.01%～0.1%［3］，而在病因不明的慢性肝病、HBsAg 陰性肝癌患者中，隱匿性HBV 感染率分別高達(dá)28.3%和70.4%［4］。由于隱匿性乙型肝炎患者血清HBV DNA 拷貝數(shù)較低，有時無法通過HBV DNA 檢測發(fā)現(xiàn)。鑒于此，臨床迫切需要一種敏感度、特異度較高的隱匿性乙型肝炎診斷技術(shù)。眾多研究表明，微小RNA（microRNA，miR）在HBV 復(fù)制以及乙型肝炎發(fā)生和進(jìn)展過程中具有重要作用，如miR-122、miR-150，2 者在肝癌細(xì)胞中均呈異常表達(dá)［5-6］。本研究旨在探討miR-122 和miR-150 在隱匿性乙型肝炎鑒別診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇本院2018年3月至2019年2月收治的45例隱匿性乙型肝炎患者（A組）、60例慢性乙型肝炎患者（B組）和50例健康人（C組）作為研究對象。3組年齡和性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），B 組血清HBsAg、HBeAg、HBV-DNA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著高于A 組和C 組，而HBsAb陽性率顯著低于A組和C組（P＜0.05），見表1。

表1 3 組研究對象基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data of 3 groups of subjects

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性乙型肝炎［7］、隱匿性肝炎［8］診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18 歲；③無肝硬化跡象或者其他系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①罹患其他肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染者；②合并嚴(yán)重肝、腎功能異常及免疫功能缺陷者；③有結(jié)核病、血吸蟲病史；④酒精性脂肪肝、酗酒、脂肪肝等。所有患者均已簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

RNeasy Mini Kit 購自德國QIAGEN 公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqMan 快速通用PCR 反應(yīng)液購自美國Applied Biosystems公司。miR-122、miR-150 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。高速離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)均為德國Eppendorf 生產(chǎn)。AGT9601 型普通PCR 儀購自杭州安杰思生物科技有限公司。7500 型熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

抽取患者空腹靜脈血約4 mL，混勻后于2 h 內(nèi)通過3 000×g離心15 min，收集血清，-80℃低溫凍存待檢。

1.3.2 血清miR-122 和miR-150 檢測

①RNA 提?。翰捎肏iPure Liquid RNA/miRNA Kit 從250 μL 血清中提取總RNA。②cDNA合成：采用First Strand cDNA Synthesis Kit 以總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系：RNA-primer Mix（總RNA 1 μg、250 μmol/L oligo dT primer 1 μL、無酶水至總體積13 μL）、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、25 U/μL RNase inhibitor 1μL、200 U/μL M-MLV RTase 1 μL、無酶水4 μL?；靹蚍磻?yīng)，低速離心機(jī)短暫離心后37℃孵育1 h，反應(yīng)結(jié)束后，85℃滅活處理5 min，然后用無酶水對反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5 倍，形成positive cDNA Mix。最后-20℃保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。③定量PCR 檢測：采用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR 檢測，反應(yīng)體系：2 × SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各0.6 μL（10 μmol/L），cDNA 1 μL，dH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件：95℃30 s、95℃5 s、（60℃30 s、72℃10 s）×40 循環(huán)，于72℃檢測熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行熔解曲線分析，檢測條件為72℃～95℃范圍內(nèi)0.5℃/次，10 s/次，30℃30 s。所有反應(yīng)設(shè)置3 個復(fù)孔和無模板的陰性對照，計算Ct 值，并以U6 為內(nèi)參計算標(biāo)準(zhǔn)化Ct 值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示，計數(shù)資料（%）表示。計量資料間兩組間t檢驗(yàn)，多組間比較釆用單因素方差分析，并用LSD 法進(jìn)行兩兩比較，計數(shù)資料的比較釆用卡方檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），計算血清miR-122 和miR-150 水平的ROC 曲線下面 積（Area under the ROC curve，AUC），比較miR-122 和miR-150 的診斷價值。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組血清miR-122 和miR-150 水平比較

A 組和B 組血清miR-122 和miR-150 的Ct 值顯著低于C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而A組和B 組比較，均無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表2 3 組血清miR-122 和miR-150 水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum levels of miR-122 and miR-150 in 3 groups（±s）

表2 3 組血清miR-122 和miR-150 水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum levels of miR-122 and miR-150 in 3 groups（±s）

組別A 組（n=45）B 組（n=60）C 組（n=50）F 值P 值miR-122 25.36±1.03 25.66±1.14 31.52±1.63 364.805 0.000 miR-150 24.74±1.66 24.35±1.68 29.13±1.36 145.540 0.000

2.2 血清miR-122 和miR-150 水平診斷隱匿性乙型肝炎的ROC 曲線分析

以血清miR-122 和miR150 的Ct 值作為自變量，以是否為隱匿性乙型肝炎作為因變量，繪制ROC 曲線，如圖1、表3。

圖1 血清miR-122 和miR-150 水平診斷隱匿性乙型肝炎的ROC 曲線Figure 1 ROC curves of serum levels of miR-122 and miR-150 in diagnosis of occult hepatitis B

3 討論

microRNA 是近年來腫瘤、傳染性疾病等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，現(xiàn)有研究表明microRNA 在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、治療等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］，也有研究顯示microRNA 能夠通過影響HBV 的復(fù)制和患者免疫功能，影響乙肝肝硬化和肝癌的發(fā)生和發(fā)展，如miR-122、miR-150［10］。

表3 血清miR-122 和miR-150 水平診斷隱匿性乙型肝炎的ROC 曲線分析Table 3 Analysis of ROC curve of serum levels of miR-122 and miR-150 in diagnosis of occult hepatitis B

miR-122 具有肝臟特異性，在肝臟發(fā)育、細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝、應(yīng)激反應(yīng)和肝細(xì)胞癌的發(fā)生進(jìn)展等過程的信號通路中具有重要的作用。有研究采用基因敲除技術(shù)沉默miR-122 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乙肝病毒轉(zhuǎn)染的Huh7 細(xì)胞HBsAg 和HBeAg 表達(dá)顯著降低［11］。Gao 等［12］研究則表明miR-122 表達(dá)下調(diào)可造成干擾素表達(dá)降低，進(jìn)而誘導(dǎo)HBV 感染。miR-122 表達(dá)上調(diào)能夠降低血紅素氧化酶1 表達(dá)水平［13］，而血紅素氧化酶1 具有抗HBV 作用，提示miR-122 表達(dá)上調(diào)能夠抑制HBV 復(fù)制。本研究結(jié)果表明，A 組和B 組患者血清miR-122 的Ct 值顯著低于C 組（P＜0.05）。

研究發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中miR-150 可在感染、腫瘤和自身免疫性疾病等病理狀態(tài)下呈高表達(dá)狀態(tài)［12］。但目前對miR-150的研究較少，據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果可知，miR-150 能夠抑制c-myb 基因表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，但miR-150 在不同腫瘤組織中表達(dá)水平有所差異，在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，在胃癌中則呈低表達(dá)［14］。陳淵源研究顯示慢性乙型肝炎患者和隱匿性乙型肝炎患者的血清miR-150 水平與健康者顯著高于健康者［15］。本研究結(jié)果也表明A 組和B 組患者血清miR-150 的Ct 值顯著低于健康者，提示肝炎患者血清miR-150 水平上調(diào)。

本研究采用ROC 曲線探討了血清miR-122 和miR-150 水平鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的效能，結(jié)果表明，血清miR-122 和miR-150 鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的最佳截斷Ct 值分別為28 和26，敏感度、特異度分別為95.56%、88.00%和91.58%、91.11%，2 個指標(biāo)均具有良好的診斷效能。

綜上，血清miR-122 和miR-150 鑒別診斷隱匿性乙型肝炎具有良好的敏感性和特異性，可進(jìn)一步探討兩種miRNA 在HBV 感染、復(fù)制和乙型肝炎進(jìn)展中的作用機(jī)制，以確定miR-122 和miR-150 應(yīng)用的效能和安全性。