高靈敏度HBV DNA臨床檢測應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

里進(jìn) 李一榮

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個嚴(yán)重的全球性公共健康問題，全球約20 億人感染過HBV，其中2.57 億人為慢性HBV 感染者［1］，每年約有65 萬人死于HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）［2］。目前，HBV 感染的病毒學(xué)診斷和監(jiān)測主要依據(jù)免疫學(xué)檢測和核酸檢測，而核酸檢測由于可以準(zhǔn)確定量，并能實(shí)時監(jiān)測病毒感染狀態(tài)和抗病毒療效，因此在乙肝臨床診斷和決策中有著突出的臨床價值［3］。近年來，高靈敏度HBV DNA 技術(shù)因其檢測下限低和線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到臨床醫(yī)生的關(guān)注，許多專家和指南也將高靈敏度HBV DNA 檢測結(jié)果作為乙肝病毒核苷酸類藥物治療終點(diǎn)的重要指標(biāo)。雖然高靈敏度HBV DNA 檢測目前在臨床應(yīng)用過程中還存在諸多問題，但由于其技術(shù)自身的優(yōu)勢，未來將成為HBV-DNA 檢測發(fā)展的必然方向。

1 高靈敏度HBV DNA 臨床檢測應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 國內(nèi)外行業(yè)指南

除了指導(dǎo)臨床合理停藥，高靈敏度HBV DNA檢測還在術(shù)前/輸血前篩查［4］、化療/免疫抑制劑治療監(jiān)測［5］、器官移植病毒殘留檢測［6］以及隱匿性HBV 感 染（occult hepatitis B virus infection，OBI）檢測［7］等方面起到了關(guān)鍵性作用，相關(guān)行業(yè)指南也針對高靈敏度HBV DNA 檢測做了說明（參見表1）：①亞太肝病學(xué)會（Asian Pacific Association for the Study of Liver，APASL）在2015 版的乙型肝炎防治指南中指出對于持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答（sustained virologic response，SVR）患 者，當(dāng)HBV DNA≥100 IU/mL 時判斷為HBV 復(fù)發(fā)。對于HBV DNA 低于檢測下限的含義，APASL 明確指出高靈敏度HBV DNA 檢測應(yīng)為＜12 IU/mL［8］；②美國肝病學(xué)會（American Association for the Study of Liver Disease，AASLD）在2018 版的慢性乙型肝炎防治指南中指出慢乙肝病人乙肝表面抗原陰轉(zhuǎn)后，通常表現(xiàn)較低的HBV DNA 水平（20～200 IU/mL），如果這類人群始終沒能產(chǎn)生乙肝表面抗體，其肝癌發(fā)生率和非活動性慢乙肝病人類似［9］。AASLD還給出了幾種主要核苷酸類藥物治療的cut-off值：恩替卡韋和替諾福韋＜60 IU/mL 時判斷抑制乙肝病毒有效；替諾福韋艾拉酚胺（二代替諾福韋）＜29 IU/mL 時判斷抑制乙肝病毒有效；③歐洲肝病學(xué)會（European Association for the Study of the Liver，EASL）2017 版的乙型肝炎感染防治指南寫到對于高靈敏度HBV DNA 檢測，核苷酸類藥物病毒學(xué)應(yīng)答定義為＜10 IU/mL。EASL 同時指出對于乙肝肝硬化失代償人群，HBV DNA＞20 IU/mL 患者比HBV DNA＜20 IU/mL 患者更易發(fā)展為肝癌［10］；④世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2015 版的慢性乙型肝炎感染防治指南規(guī)定高靈敏度HBV DNA＜15 IU/mL 時為未檢出HBV 病毒［11］；⑤我國中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會2015年出版的慢性乙型肝炎防治指南中并未明確指出高靈敏度HBV DNA 檢測的下限，但對于乙型肝炎再活動的定義也是≥100 IU/mL，此外，對于非活動性HBV 攜帶者必須滿足HBV DNA 低于檢測值下限或＜200 IU/mL［2］。

表1 各指南關(guān)于高靈敏度檢測HBV-DNA 臨床應(yīng)用說明Table 1 Guidelines for Clinical Application of the ultrasensitive HBV-DNA detection

1.2 高靈敏度HBV DNA 試劑

從以上各指南可以看出，國內(nèi)外專家均高度肯定了高靈敏度HBV DNA 檢測在HBV DNA 定量中的意義，這一方面是因?yàn)闃O低水平的HBV DNA 在部分人群中確實(shí)有著重要的臨床意義，另一方面也是因?yàn)閭鹘y(tǒng)HBV 檢測已不能滿足目前臨床的需求。正因如此，已有不少針對高靈敏度HBV DNA 檢測的方法學(xué)研究報道［12-14］，成品的試劑盒也逐漸得到中國食品藥品監(jiān)督局（China food and drug administration，CFDA）批準(zhǔn)進(jìn)入我國市場。表2列舉出幾家主要的高靈敏度HBV DNA試劑廠家（均經(jīng)CFDA 批準(zhǔn)），進(jìn)口試劑有3 家，國產(chǎn)試劑有5 家。由于磁珠法核酸提取效率最高，這8 家高靈敏度試劑廠家均采取了磁珠法提取HBV 核酸。此外，這8 家試劑廠家HBV 檢測靈敏度也都能達(dá)到10～15 IU/mL，不少試劑可以達(dá)到10 IU/mL，但是在一些關(guān)鍵參數(shù)上各有不同，主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：①血清/血漿提取量：國外試劑基本取0.5 mL 血清/血漿做核酸提取，國內(nèi)只有復(fù)星一家試劑提取量＞0.5 mL，血清/血漿提取體積越大納入的HBV DNA 載量也越大，假陰性率越低；②上樣量：上樣量指的是加入到PCR 體系中的HBV 核酸洗脫液體積，目前只有羅氏和圣湘兩家試劑可將提取好的全部核酸連同磁珠一起上PCR儀擴(kuò)增，其他產(chǎn)品只能將提取的部分核酸（20～40 μL）進(jìn)行PCR，因此存在丟失核酸的風(fēng)險，核酸丟失會使PCR 結(jié)果產(chǎn)生偏差而偏離真實(shí)值；③HBV基因型覆蓋度：有少數(shù)幾家基因型覆蓋不全，對特殊基因型有漏診的風(fēng)險；④內(nèi)標(biāo)：除羅氏是定量內(nèi)標(biāo)外，其他廠商試劑內(nèi)標(biāo)都屬于競爭性內(nèi)標(biāo)/非競爭性內(nèi)標(biāo)，不參與定量，也不能監(jiān)控各管的擴(kuò)增效率，如果樣本中存在黃疸、溶血等干擾因素，將對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響；⑤成本差異：羅氏公司COBAS HBV DNA 高靈敏度試劑因其性能優(yōu)異，是國內(nèi)外同行公認(rèn)的參比試劑，但其成本過于昂貴，患者難以承受，臨床使用較少。相比之下國內(nèi)試劑及耗材成本低廉，儀器通用性好，在許多醫(yī)院也得到了應(yīng)用。因此，雖然這些試劑都稱作高靈敏度HBV DNA 檢測，但在檢驗(yàn)效能上還是存在一定的差異。

表2 部分高靈敏度HBV-DNA 試劑生產(chǎn)廠家對比Table 2 Comparison of these different ultrasensitive HBV-DNA detection reagents

2 高靈敏度HBV DNA 臨床檢測應(yīng)用過程中的問題及對策

2.1 核酸污染

高靈敏度核酸檢測對臨床基因擴(kuò)增（PCR）實(shí)驗(yàn)室來說猶如“達(dá)摩克利斯之劍”，雖然擁有極高的檢出能力，但也有著無法回避的問題，這個問題就是檢測結(jié)果容易受核酸污染的影響［15-16］。核酸污染會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，一旦發(fā)生后，圍繞整個PCR 實(shí)驗(yàn)室尋找污染源是一件十分耗時、耗力的事情。輕度核酸污染要終止實(shí)驗(yàn)，待污染清除之后再開始，重度核酸污染可能需要更換設(shè)備、儀器甚至場地。PCR 實(shí)驗(yàn)室最常見的污染源是氣溶膠（aerosol），產(chǎn)生氣溶膠最主要的操作環(huán)節(jié)是提取和擴(kuò)增步驟［17］。有研究報道一個109copies 擴(kuò)增產(chǎn)物其產(chǎn)生的最小氣溶膠中靶序列核酸含量也有106copies［18］。如果氣溶膠污染不加控制，在相對較短的時間內(nèi)，氣溶膠中的核酸產(chǎn)物就可能污染移液器、試劑、設(shè)備、桌面地面、生物安全柜以及整個通風(fēng)系統(tǒng)［19］。因此，各開展高靈敏度HBV DNA 檢測的單位應(yīng)對核酸污染防控應(yīng)給予高度重視，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standard operating procedures，SOP）要嚴(yán)于普通HBV DNA 檢測流程。

以下結(jié)合我單位的工作經(jīng)驗(yàn)，列舉幾點(diǎn)主要注意事項(xiàng)：①高靈敏度核酸檢測建議在全自動封閉式核酸提取系統(tǒng)中進(jìn)行，樣本提取純化后自動轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，整個過程未經(jīng)任何開蓋操作，可最大限度的防止氣溶膠的產(chǎn)生；②全自動核酸提取系統(tǒng)建議單獨(dú)一間房間使用，不應(yīng)與普通HBV DNA 檢測共用一間房間，因?yàn)槠胀ê怂崽崛《嗖捎弥蠓蟹?，極易產(chǎn)生氣溶膠，造成交叉污染；③選用含有UNG 酶/dUTP 防污染體系的試劑，這類試劑盒以dUTP 取代dTTP，所以PCR 產(chǎn)物都含有dU 堿基。PCR 開始前增加50℃2 min 步驟，UNG 酶即可特異性地將反應(yīng)體系中殘留U-DNA污染物序列降解，并在95℃時被滅活，不會再降解新擴(kuò)增的產(chǎn)物U-DNA，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。④實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后常規(guī)消毒、紫外線照射，每天實(shí)驗(yàn)前用75%酒精擦拭需要使用的移液器和設(shè)備，實(shí)驗(yàn)后用噴壺對全房空氣噴灑75%酒精，用含氯量500 mg/L 的84 消毒液拖地，用75%酒精擦拭使用過的移液器、桌面和設(shè)備，可有效消除和防控氣溶膠的污染；⑤定期監(jiān)控，可將多個裝有純凈水的Ep 管打開靜置于提取及擴(kuò)增檢測區(qū)30～60 min，同時用沾水的棉簽擦拭使用過的移液器、桌面和設(shè)備，將這些監(jiān)控物同樣本一樣提取上機(jī)擴(kuò)增，若為陽性則說明實(shí)驗(yàn)室有核酸污染的存在。⑥其他方面，如實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)計(jì)、人員物品流向、空氣流向、擴(kuò)增產(chǎn)物處理等按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》執(zhí)行［20］。

2.2 行業(yè)監(jiān)管及標(biāo)準(zhǔn)

目前，高靈敏度HBV DNA 檢測國內(nèi)外暫沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）針 對 臨 床PCR 實(shí)驗(yàn)室最新一版管理文件CNAS-CL02-A009：2018 也沒有相關(guān)說明和要求［21-22］。室內(nèi)質(zhì)控、試劑盒性能驗(yàn)證、精密度與正確度的判定、抗干擾能力等相關(guān)質(zhì)量管理程序都處在空缺的狀態(tài)。此外，臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室評審和省部級臨檢中心也沒有涉及高靈敏度HBV DNA 檢測的項(xiàng)目，這都為高靈敏度HBV DNA 檢測標(biāo)準(zhǔn)化管理帶來了不少難度。盡管行業(yè)監(jiān)管及標(biāo)準(zhǔn)缺如，但開展高靈敏度HBV DNA 檢測的單位卻越來越多，從第三方檢測機(jī)構(gòu)、醫(yī)院檢驗(yàn)科到各小型實(shí)驗(yàn)室都有，報告單上雖然都標(biāo)注的是高靈敏度HBV DNA 檢測，但背后的質(zhì)量卻參差不齊。因此，盡快形成一個高靈敏度HBV DNA 檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是一件迫在眉睫的事情。

3 高靈敏度HBV DNA 檢測發(fā)展趨勢

從表1可以看出，部分指南將高靈敏度HBV DNA 檢測下限定在10～15 IU/mL，雖然本文列舉的產(chǎn)品靈敏度能達(dá)到10 IU/mL，但這些試劑檢測下線多在20 IU/mL，這意味著10～20 IU/mL 的樣本多數(shù)情況下是測不準(zhǔn)的，因此，目前的試劑檢測性能離各專業(yè)學(xué)會的指南要求還有一定的差距，需繼續(xù)發(fā)展新的檢測技術(shù)（如數(shù)字PCR，digital PCR）去探尋更低的檢測下限。例如，Liu Y 等人將羅氏COBAS TaqMan 方法與數(shù)字PCR 方法同時檢測替諾福韋治療后的人群發(fā)現(xiàn)，羅氏COBAS是無法區(qū)分＜58 copies/mL 的患者，而數(shù)字PCR 檢測能力可以低至8 copies/mL［23］（1 IU/mL≈5.3 copies/m［11］）。Hui Tang 等人利用pAAV/HBV 1.2 質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR 方法的檢測上線是105copies，而下限甚至達(dá)到1 copy［24］。最近，魯鳳民等人建立了一種跨缺口數(shù)字PCR 技術(shù)，不但可以高靈敏度的檢測HBV DNA 載量，還可以特異性檢測隱匿性乙肝人群（OBI）中有HBV 復(fù)制能力的病毒核酸片段（松弛環(huán)狀雙鏈DNA，rcDNA 和共價閉合環(huán)狀DNA，cccDNA），從而更加精準(zhǔn)的評估OBI 人群的預(yù)后［7］。

隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，HBV DNA 檢出能力會越來越高，但這并不意味著每個乙肝患者都需要高靈敏度HBV DNA 檢測。國內(nèi)外指南雖然對慢性乙型肝炎抗病毒治療的診斷標(biāo)準(zhǔn)不同，但對于HBV DNA 的治療水平都基本一致，例如對于HBeAg 陽性（大三陽）患者，中國、亞太和美國指南建議HBV DNA≥20 000 IU/mL，HBeAg 陰性（小三陽）患者HBV DNA≥2 000 IU/mL 需接受抗病毒治療；歐洲和英國指南較為謹(jǐn)慎，不考慮HBeAg 狀態(tài)，其HBV DNA＞2 000 IU/mL 則需要接受抗病毒治療［25-26］（各指南建議的慢性乙型肝炎抗病毒治療指征參見表3）。由此可見，對于大多數(shù)慢性乙肝患者抗病毒治療的初期是不需要使用高靈敏度HBV DNA 檢測，僅在評估停藥時間點(diǎn)上需要使用到高靈敏度HBV DNA。因此，臨床醫(yī)生可根據(jù)患者的病情，選擇合適的方法去檢測，如當(dāng)HBV DNA＞2 000 IU/mL 時，性價比高的普通HBV DNA 檢測仍然是可靠的；當(dāng)HBV DNA＜500 IU/mL（傳統(tǒng)HBV DNA 檢測下限）時，亦或是特殊乙肝人群（輸血、移植、隱匿性感染等），敏感度更高的高敏HBV DNA 檢測技術(shù)才能體現(xiàn)其價值。

表3 各指南關(guān)于慢性乙型肝炎抗病毒治療的指征Table 3 The recommendations for antiviral treatment of chronic hepatitis B in the guidelines

4 總結(jié)

在“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)，精準(zhǔn)治療”的時代背景下，高靈敏度HBV DNA 檢測是大勢所趨。在保證檢測質(zhì)量的前提下，高靈敏度HBV DNA 檢測項(xiàng)目如能進(jìn)一步降低成本并納入醫(yī)保，將必然取代傳統(tǒng)乙肝病毒核酸檢測方法。雖然目前這一領(lǐng)域還存在不少問題和瓶頸，但隨著技術(shù)的進(jìn)步和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的推廣，相信以高靈敏度HBV DNA 檢測為代表的感染性病原體精準(zhǔn)檢測將逐步規(guī)范并廣泛應(yīng)用于臨床，最終造福每一位患者。