兩種HCV RNA定量檢測方法的臨床對比研究

彭亞柏 彭雅蘭 管吉鵬 王敏

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起的病毒性肝炎，簡稱丙型肝炎或丙肝，通過血液傳播、性傳播、母嬰傳播等其他途經(jīng)傳播。丙型肝炎病毒是單股線性正鏈RNA 病毒，是黃病毒科唯一的嗜肝病毒。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計表明，丙肝已是一種全球性流行感染病，目前全世界約有1.7 億人感染HCV，感染率是3%左右，丙肝每年新發(fā)病例達到3.5 萬例［1］，且不同年齡、性別、種族均易感HCV［2-4］。現(xiàn)階段暫無針對丙肝的疫苗，缺乏足夠的治療手段，并且因為HCV的生物學(xué)特點與感染者自身免疫功能等多方面因素影響，機體難以有效的清除病毒，所以早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療對于丙型肝炎的防治和積極阻斷轉(zhuǎn)播途徑相當(dāng)重要［5］。血清中的HCV RNA 是病毒復(fù)制和肝炎進程的確切標(biāo)志，被稱為診斷HCV 感染的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”［6］。本研究收集了132 例血清標(biāo)本，同時用某國產(chǎn)丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量檢測（簡稱國產(chǎn)試劑）和某進口（簡稱進口試劑）2 種試劑，用于評價并對比分析了2 者檢測結(jié)果的相關(guān)性和一致性，了解其在丙型肝炎早期診斷中的價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集在2019年1月至5月于深圳市第三人民醫(yī)院診治的慢性丙型肝炎患者的臨床檢測剩余血清標(biāo)本，保存在-80℃條件下。診斷均符合《2015版慢性丙型肝炎防治指南》［7］中慢性丙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。男76 例，女56 例；最大年齡78 歲，最小年齡22 歲，平均年齡（44.68±12.96）歲。

1.2 方法

每份樣本同時使用進口試劑和國產(chǎn)試劑進行平行檢測，操作過程嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)準(zhǔn)步驟進行。2 種檢測方法在檢測原理上基本一致，均采用磁珠法提取和純化核酸，核酸擴增均采用Taqman 實時熒光定量聚合酶擴增技術(shù)對血清中HCV病毒載量進行檢測［8-9］。采集血清至1.5 mL 滅菌離心管，采用核酸提取或純化試劑對樣本進行核酸提取，從試劑盒中取出HCV 反應(yīng)液，室溫融化后振蕩混勻，按比例配制反應(yīng)液，之后將20 μL 配制反應(yīng)液分裝到PCR 管中，往上述HCV 反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入提取后的待測樣本核酸、HCV 陰性質(zhì)控品、HCV 強陽性質(zhì)控品、HCV 臨界陽性質(zhì)控品和HCV 陽性定量參考品40 μL。蓋緊管蓋，8 000 rpm 離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴增檢測區(qū)擴增。2 種檢測試劑盒的詳細(xì)參數(shù)，見表1。

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用Graphpad 整理數(shù)據(jù)，使用R 3.6.0 分析及繪圖，采用配對t檢驗分析2 種檢測方法結(jié)果的差異，采用相關(guān)分析法分析不同試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性，采用Bland-Altman 模型分析2 種檢測方法結(jié)果的一致性。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 種試劑檢測結(jié)果的比較

國產(chǎn)和進口試劑檢測結(jié)果均高于檢測下限的樣本為114 例，均低于檢測下限的樣本6 例，檢測結(jié)果一致性較高，達到90.91%（120/132）。進口檢測結(jié)果中高于檢測下限樣本共114 例，占比86.36%（114/132）；國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果中高于檢測下限的樣本共126例，占比95.45%（126/132）。2種試劑檢測結(jié)果的不符合率分別為9.52%（12/126）和0%（0/114）。結(jié)果不符合的12 例樣本中，檢測結(jié)果＜100 IU/mL 的比例為8.33%（1/12），2 種試劑差值超過1 個log（6.25倍）的有12 例，均為國產(chǎn)試劑高于進口試劑。

表1 2 種測試劑的參數(shù)對比Table 1 comparison of parameter data between 2 reagents

2.2 2 種試劑檢測結(jié)果的對比分析

國產(chǎn)和進口試劑檢測結(jié)果均高于下限的114例樣本的平均HCV 血清病毒載量分別為（2.38×104～5.6×106）IU/mL 和（5.47×106～1.39×107）IU/mL，配對t檢驗顯示兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.32，P=0.001）（見圖1）。根據(jù)進口試劑的檢測結(jié)果，分別對＜1 000 IU/mL 組和＞1 000 IU/mL 組的數(shù)據(jù)進行配對t檢驗。結(jié)果表明當(dāng)病毒載量＞1 000 IU/mL 時，2 種檢測試劑的結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.45，P=0.02）（見圖2），在病毒載量＜1 000 IU/mL 時差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.30，P=0.03）（見圖3）。

圖1 2 種試劑檢測的HCV 病毒載量的對比分析Figure 1 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

圖2 2 種試劑檢測的HCV 病毒載量的對比分析Figure 2 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

圖3 2 種試劑檢測的HCV 病毒載量的對比分析Figure 3 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

2.3 2 種試劑檢測結(jié)果的一致性分析

將2 種方法檢驗結(jié)果均大于下限的114 個病毒載量值，取對數(shù)后進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.98，P＜0.001，表明兩者具有很強的相關(guān)性（見圖4）。差異分析顯示，進口試劑與國產(chǎn)試劑定量值差異平均值96%（109/114）的樣本檢測值在95%的可信區(qū)間內(nèi)，表明進口與國產(chǎn)具有較高的一致性（見圖5）。

圖4 2 種試劑檢測的HCV 病毒載量的對比分析Figure 4 Comparative analysis of HCV viral load detected by 2 reagents

圖5 2 種試劑檢測的HCV 病毒載量一致性分析Figure 5 Consistency analysis of HCV virus load detected by 2 reagents

3 討論

HCV RNA 是臨床診斷丙肝的金標(biāo)準(zhǔn)，具有早期、特異、靈敏等優(yōu)點，在丙肝感染早期診斷、進程評估、療效檢測等方面發(fā)揮了重要作用［10-12］，其中早期臨床診斷對丙肝及相關(guān)疾病的治療和預(yù)后極其重要。血液傳播是HCV 的主要傳播途徑，同時也是病毒性肝炎發(fā)生的主要因素之一［13］。從發(fā)病機制看，當(dāng)HCV 進入人體內(nèi)時，其會誘發(fā)病毒血癥，同時在肝細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，阻礙細(xì)胞內(nèi)的大分子合成，增加溶酶體膜通透性，進而導(dǎo)致細(xì)胞的病變，同時導(dǎo)致機體內(nèi)肝臟等多器官損害［14］。目前臨床通過注射疫苗的方式來預(yù)防甲型肝炎病毒與乙型肝炎病毒，然而目前尚無針對丙型肝炎病毒與丁型肝炎病毒疫苗，因此合理的篩查對于丙肝的臨床診治意義重大。

隨著醫(yī)療環(huán)境的改善，特別是隨著新醫(yī)改方案出臺，臨床的血液供量不斷增加，為了保證用血需求，減少血源的浪費，降低檢測的假陽性率，有必要探索具備較高特異性及敏感性的檢測方法［15］。本研究選擇用進口試劑與國產(chǎn)試劑對比，是因為2 種試劑檢測原理相同，都基于實時熒光定量PCR；通過這樣的研究可以進一步了解國產(chǎn)試劑的具體性能。

在本次研究中，國產(chǎn)和進口檢測結(jié)果均高于檢測下限的樣本為114 例，均低于檢測下限的樣本6 例，檢測結(jié)果一致性較高，達到90.91%（120/132）。雖然工作原理相同，國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果大于檢測下限的樣本比例稍高于進口試劑；國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的不符合率也高于進口試劑，國產(chǎn)試劑線性范圍下限是20 IU/mL，而進口試劑的15 IU/mL 稍低于國產(chǎn)試劑，盡管如此，檢測結(jié)果不相符的12 例樣本中8.33%（1 例）病毒載量小于100 IU/mL，對于臨床監(jiān)測治療效果和預(yù)測耐藥發(fā)生無影響。

通過深入分析檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)2 種試劑檢測的病毒載量值在＞1 000 IU/mL 的樣本中差異顯著，而在＜1 000 IU/mL 的樣本中，不僅差異顯著還呈現(xiàn)了負(fù)相關(guān)性。

盡管2 種試劑的檢測結(jié)果具有較高的一致性，兩者相關(guān)系數(shù)達到0.98，仍有12 例樣本的檢測結(jié)果差異超過1 個log（6.25 倍），推測可能是試劑靶點的不同導(dǎo)致了該差異出現(xiàn)，HCV 在不同樣本中的序列存在一定的差異性，也會導(dǎo)致不同的實際檢測效能存在一定的差異。

綜上所述，在丙型肝炎臨床診斷中，國產(chǎn)與進口試劑均有其各自的優(yōu)缺點，且2 者具有較高的一致性，適合臨床監(jiān)測抗病毒治療效果。國產(chǎn)試劑特異性高，便于操作，容易上手，性價比較高，同時對檢驗人員技術(shù)水平和儀器設(shè)備無特殊要求；而進口試劑具有靈敏度高，影響因素少，結(jié)果準(zhǔn)確，更適合于窗口期感染者篩查，可以將其當(dāng)作早期診斷HCV 感染的有效檢測方法。因此在臨床上應(yīng)根據(jù)患者具體情況對丙型肝炎病毒抗體檢測中選用針對性強的檢測方法。

世界衛(wèi)生組織號召全人類行動起來，至2030年可以全面消滅慢性乙型/丙型病毒性肝炎對人類造成的健康威脅，從而使全世界的病毒性肝炎新發(fā)感染人數(shù)能減少90%?？偹苤獜膫魅驹瓷献钄嗖《镜膫鞑U散，對控制疾病以及降低發(fā)病率意義重大，故采取有效的HCV RNA 定量檢測方法，并將其靈活運用至臨床中具有重大意義。