高靈敏度HCV RNA檢測(cè)在慢性丙型肝炎患者中的診斷及治療檢測(cè)應(yīng)用

黃成軍 程書權(quán)

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA 載量測(cè)定是判斷丙型肝炎現(xiàn)行感染和治療效果的基本手段，目前應(yīng)用的有普通檢測(cè)方法（檢測(cè)下限＜1 000 IU/mL）和高靈敏度檢測(cè)方法（檢測(cè)值下限為15～20 IU/mL），既往由于后者的檢測(cè)試劑只有羅氏、雅培等國(guó)外公司提供，價(jià)格昂貴，故我國(guó)大多數(shù)地區(qū)由于經(jīng)濟(jì)條件的限制，HCV RNA 臨床實(shí)驗(yàn)室以普通檢測(cè)方法占主導(dǎo)，以手動(dòng)操作為主，易污染出現(xiàn)假陽(yáng)性［1］，檢測(cè)結(jié)果線性范圍窄，靈敏度低，不能用于準(zhǔn)確判斷病毒學(xué)應(yīng)答情況［2|，近年，隨著達(dá)安等國(guó)內(nèi)廠家的高靈敏度HCV RNA 試劑及檢測(cè)方法的面世，大大降低了成本，使其普及成為可能。本研究同時(shí)使用2 種HCV RNA 檢測(cè)方法應(yīng)用于慢性丙型肝炎患者的診斷及治療后對(duì)比，以探討2 種檢測(cè)方法在慢性丙型肝炎的篩查、診斷和療效判斷的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年12月至2019年3月到本院初次就診的130 例丙肝抗體陽(yáng)性的患者為初治組，所有患者均未接受過(guò)抗病毒治療。同時(shí)收集既往曾經(jīng)抗病毒治療，療程結(jié)束后用普通方法檢測(cè)結(jié)果為陰性且達(dá)到12 周持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（sustained virological response，SVR）的148 例患者為停藥組。另選取2018年6月至2019年3月就診的慢性丙型肝炎初治患者46 例，予抗病毒治療，治療前均行HCV 基因分型檢查確定為1b 型。停藥組及行抗病毒治療的患者均符合《丙型肝炎防治指南》的慢性丙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾接受過(guò)抗HCV 治療的患者；②合并其他嗜肝病毒感染，如乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒等；③合并其他類型的肝病，如自身免疫性肝病等；④發(fā)生肝硬化或者原發(fā)性肝癌；⑤合并其他免疫系統(tǒng)疾病或孕期婦女：⑥依從性差不能配合治療和隨訪者。本研究均獲得患者知情同意簽字并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法

46 例1b 型慢性丙型肝炎患者給予達(dá)諾瑞韋鈉片（商品名：戈諾衛(wèi)，歌禮藥業(yè)（浙江）有限公司，用法：100 mg/次，2 次/d），聚乙二醇干擾素a-2a 注射液（商品名：派羅欣，上海羅氏制藥有限公司，用法：180 ug/次，1 次/d），利托那韋（商品名：艾治威，AbbVie Deutschland GmbH ，德國(guó)，用法：100 mg/次，2 次/d），利巴韋林（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，用法：500 mg/次，2 次/d）。均予患者強(qiáng)調(diào)抗病毒治療的依從性，囑家屬監(jiān)督按時(shí)、按量服藥，療程12 周。

1.3 檢測(cè)儀器與試劑

普通檢測(cè)方法采用DA-7600 熒光定量PCR 儀，檢測(cè)試劑為丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?，儀器設(shè)備及試劑均購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

高靈敏度檢測(cè)方法采用SLAN-96P 全自動(dòng)熒光檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)試劑為高靈敏丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ怂崽崛』蚣兓噭┡涮譙mart32 核酸提取儀使用，除擴(kuò)增儀器購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司，其余儀器設(shè)備及試劑均由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

1.4 檢測(cè)方法

普通HCV RNA 檢測(cè)方法：按照丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒提供的核酸提取試劑對(duì)血清進(jìn)行處理和核酸提取，然后進(jìn)一步行PCR 擴(kuò)增。循環(huán)條件如下：50℃15 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；94℃15 s 至55℃45 s，45 個(gè)循環(huán)。高靈敏HCV RNA 檢測(cè)方法：按照高靈敏丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒提供的試劑對(duì)血清進(jìn)行處理，根據(jù)核酸提取或純化試劑和Smart32 核酸提取儀的說(shuō)明書進(jìn)行核酸提取，然后進(jìn)一步行PCR 擴(kuò)增。循環(huán)條件如下：50℃15 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃15 min，1 個(gè)循環(huán)；94℃15 s 至55℃45 s，45 個(gè)循環(huán)。

1.5 觀察指標(biāo)

記錄2 種檢測(cè)方法檢測(cè)初治組和停藥組的陽(yáng)性率，記錄46 例1b 型慢性丙型肝炎患者治療前及治療2 周、4 周、12 周后2 種檢測(cè)方法檢測(cè)為陽(yáng)性的例數(shù)，并進(jìn)行對(duì)比分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 種檢測(cè)方法在初治組和停藥組的比較

初治組采用普通檢測(cè)方法陽(yáng)性率96.2%，高靈敏度檢測(cè)方法陽(yáng)性率96.9%，兩者對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥組普通檢測(cè)方法陽(yáng)性率4.1%，高靈敏度檢測(cè)方法陽(yáng)性率10.8%，后者陽(yáng)性率高于前者（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 2 種方法在初治組和停藥組的檢測(cè)結(jié)果比較［n（%）］Table 1 Comparison of 2 methods in the intial treatment group and the drug withdrawal group［n（%）］

2.2 2 種檢測(cè)方法在抗病毒治療過(guò)程中的比較

46 例1b 型慢性丙型肝炎患者治療前2 組檢測(cè)均為陽(yáng)性，高靈敏度檢測(cè)方法組在治療后2 周檢測(cè)HCV RNA 陽(yáng)性率均明顯高于普通檢測(cè)方法組（P＜0.05），兩種檢測(cè)方法治療前、治療4 周后及治療12周后對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 2 種方法在46 例患者抗病毒過(guò)程中的檢測(cè)陽(yáng)性率結(jié)果比較［n（%）］Table 2 Comparing the positive percentages in the process of antiviral treatment with 2 methods［n（%）］

3 討論

近年，隨著我國(guó)衛(wèi)生健康事業(yè)的發(fā)展，許多傳染病如麻風(fēng)病、麻疹、鼠疫等已經(jīng)基本消滅或得到良好控制，在病毒性肝炎方面，由于母嬰阻斷治療的廣泛應(yīng)用和疫苗計(jì)劃免疫的實(shí)施，我國(guó)新生人口的乙肝發(fā)病率已大大下降，而丙型肝炎作為一個(gè)“沉默的殺手”，已漸漸浮出水面。目前全世界約有1.85 億人感染HCV，其中60%～85% 的HCV 感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎［4］，而我國(guó)約1 000 萬(wàn)HCV 感染患者，在高流行區(qū)域，由于注射毒品及性傳播，丙肝患病率甚至可超過(guò)60%［5］。慢性丙型肝炎患者多無(wú)不適癥狀，且半數(shù)以上者無(wú)明顯肝功能異常，就診原因常為出現(xiàn)HCV 感染的肝外癥狀（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合癥或腎小球腎炎等）或者發(fā)展到肝硬化、肝癌后出現(xiàn)一系列癥狀和并發(fā)癥而就診。慢性丙型肝炎患者病情雖進(jìn)展緩慢，最終可能發(fā)展至肝硬化或肝細(xì)胞肝癌［6-7］，由于HCV 感染目前仍無(wú)有效疫苗預(yù)防，所以及早明確診斷并予治療是防治慢性丙型肝炎的關(guān)鍵。HCV RNA 是確認(rèn)丙型肝炎現(xiàn)癥感染的檢驗(yàn)手段，患者只要被檢測(cè)出HCV RNA 陽(yáng)性就應(yīng)進(jìn)行抗病毒治療，這已成為國(guó)內(nèi)外的一致共識(shí)，故HCV RNA 檢測(cè)已成為慢性丙型肝炎的診斷和治療前評(píng)估的重要依據(jù)。本研究采用普通檢測(cè)方法和高靈敏度檢測(cè)方法對(duì)我院就診的130 例未經(jīng)治療的慢性丙型肝炎患者進(jìn)行HCV RNA 檢測(cè)，結(jié)果提示，對(duì)于慢性丙型肝炎的診斷，使用普通檢測(cè)方法和高靈敏度檢測(cè)方法進(jìn)行HCV RNA 的檢測(cè)效果相當(dāng)，但對(duì)于經(jīng)治患者，在判斷是否出現(xiàn)停藥后復(fù)發(fā)時(shí)，使用高靈敏度檢測(cè)方法明顯優(yōu)于普通方法。

慢性丙型肝炎治療的目標(biāo)是控制肝臟炎癥及纖維化，預(yù)防或減少HCV 感染導(dǎo)致的并發(fā)癥，改善患者生活質(zhì)量、切斷HCV 的持續(xù)傳播，而這一切需要通過(guò)抗病毒治療來(lái)實(shí)現(xiàn)。抗病毒治療的成功標(biāo)準(zhǔn)是早期達(dá)到快速病毒學(xué)應(yīng)答（rapid virological response，RVR）及爾后保持SVR。SVR 是治療后出現(xiàn)RVR 的有效延續(xù)，故治療時(shí)的HCV RNA的轉(zhuǎn)陰率及其出現(xiàn)時(shí)間成為了關(guān)鍵。歐洲肝病研究學(xué)會(huì)（EASL）早把高靈敏的HCV RNA 檢測(cè)方法作為監(jiān)測(cè)抗病毒治療效果的首選［8］，普通檢測(cè)方法因其靈敏度較低往往不能準(zhǔn)確的判斷病毒學(xué)應(yīng)答情況［2］。本研究采用普通方法和高靈敏方法檢測(cè)抗病毒治療過(guò)程中的HCV RNA 的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)：在抗病毒治療2 周后，HCV RAN 雖快速下降，但大部分患者血清中仍存在少量HCV RNA，由于普通檢測(cè)方法靈敏度不高，其HCV RNA 陽(yáng)性率明顯低于高靈敏度檢測(cè)方法組。所以，使用高靈敏度的HCV RNA 檢測(cè)方法有助于更準(zhǔn)確鑒定真實(shí)的RVR，排除假陰性，從而為確定抗病毒治療療程提供更可靠的依據(jù)［9］，治療4 周后及治療12 周后2 種檢測(cè)方法對(duì)比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，值得注意的是，自DAAs 上市以來(lái)，丙型肝炎的抗病毒治療有效率雖明顯提高［10-11］，但至今仍無(wú)有效率達(dá)100%的治療方案，正如本研究中所發(fā)現(xiàn)的一樣，治療12 周后仍有1 例患者使用高靈敏度方法能檢測(cè)出HCV RNA，如該患者抗病毒治療過(guò)程中使用普通方法檢測(cè)HCV RNA 變化，可能出現(xiàn)假陰性，未能及時(shí)調(diào)整方案，從而導(dǎo)致治療失敗，如使用高靈敏度方法在治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)HCV RNA，可真實(shí)反映治療效果，臨床醫(yī)生可根據(jù)HCV RNA 變化及時(shí)調(diào)整治療方案，才可使治愈率進(jìn)一步提升從而盡可能接近100%。

HCV RNA 的2 種檢測(cè)方法外在表現(xiàn)為檢測(cè)指下限不同，可能與2 者檢測(cè)操作過(guò)程中核酸提取方式不同有關(guān)。普通方法使用丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒自帶的一步法提取，高靈敏度方法使用核酸提取或純化試劑在Smart32 核酸提取儀上進(jìn)行核酸提取，后者更先進(jìn)的核酸提取方式使核酸提取純度和精確度大大提升，從而使其檢測(cè)結(jié)果更靈敏和準(zhǔn)確。采用高靈敏度HCV RNA 檢測(cè)方法可及時(shí)判斷慢性丙型肝炎治療后有無(wú)復(fù)發(fā)，必要時(shí)進(jìn)行再治療，進(jìn)一步控制疾病進(jìn)展，降低肝硬化及肝癌的發(fā)生率；同時(shí)，使用高靈敏度HCV RNA 檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)抗病毒治療過(guò)程中的病毒量變化，可發(fā)及時(shí)現(xiàn)治療效果不佳的患者，盡早調(diào)整治療方案，從而提高治療有效率，避免和減少治療失敗后二次治療的高額費(fèi)用，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。故我們認(rèn)為高靈敏度HCV RNA 檢測(cè)方法是慢性丙型肝炎抗病毒治療及停藥后復(fù)查監(jiān)測(cè)的首選。

綜上所述，與普通HCV RNA 檢測(cè)方法相比，高靈敏度檢測(cè)法用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)慢性丙型肝炎患者的療效靈敏性更高，可用于指導(dǎo)慢性丙型肝炎的療效評(píng)估。