兩種HBV DNA定量檢測(cè)方法的臨床對(duì)比研究

王爽 郭杰 王大剛 時(shí)景仁 潘美晨 殷商啟 何超男 孟歡 張響 王雅杰

在目前全球面臨的最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是最大的問題之一，目前全球慢性感染者逾2.57 億人，每年死亡88.7 萬(wàn)人，其中約25%死于肝癌或肝臟相關(guān)并發(fā)癥［1］。最大限度地長(zhǎng)期抑制HBV 復(fù)制是慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者的治療目標(biāo)之一［2］。HBV DNA 定量檢測(cè)主要用于判斷慢性HBV 感染的病毒復(fù)制水平，HBV DNA復(fù)制水平越高，傳染性就越強(qiáng)［3］。HBV DNA 是反映HBV 復(fù)制的最直接、最可靠的指標(biāo)，在評(píng)價(jià)乙型肝炎藥物的療效與預(yù)后判定等方面具有至關(guān)重要的作用［4］。

熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)HBV DNA 具有靈敏度高特異性好的特點(diǎn)［5］。目前國(guó)產(chǎn)的HBV DNA熒光定量PCR 試劑種類很多，各類試劑之間的性能參數(shù)如靈敏度、特異性、線性范圍等方面存有差異［6-7］。臨床檢測(cè)使用國(guó)產(chǎn)試劑，開展HBV 血漿病毒載量檢測(cè)，相較于采用進(jìn)口試劑不但能及時(shí)監(jiān)測(cè)患者療效，又能降低患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究采用某國(guó)產(chǎn)超敏HBV 病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱國(guó)產(chǎn)試劑）和目前國(guó)際上普遍認(rèn)可的某進(jìn)口試劑（簡(jiǎn)稱進(jìn)口試劑）這2 種試劑盒對(duì)乙型肝炎患者血漿中的病毒載量進(jìn)行平行檢測(cè)，通過對(duì)2 種檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性進(jìn)行對(duì)比分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年2月至6月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院就診的本院門診及住院乙型肝炎患者的血漿514 例，所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》。選擇的患者均為單一HBV 感染，排除其他肝炎病毒或原因引起的肝病，同時(shí)選擇無(wú)黃疽、溶血和脂血的樣本。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

進(jìn)口HBV 定量檢測(cè)系統(tǒng)采用COBAS AmpliPrep 提取儀，標(biāo)本用量為600 μL；擴(kuò)增試劑為COBAS HBV Test，v2.0（瑞士，Roche）。國(guó)產(chǎn)HBV定量檢測(cè)系統(tǒng)采用Smart 32 全自動(dòng)核酸提取儀（磁珠法），標(biāo)本用量為200 μL；擴(kuò)增試劑采用超敏PCR 擴(kuò)增試劑（購(gòu)自國(guó)產(chǎn)中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），檢測(cè)儀器采用美國(guó)ABI 7500 型熒光定量PCR 儀。

1.3 方法

將514 例血漿標(biāo)本分別用進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)試劑，按照試劑盒說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行平行檢測(cè)。2 種HBV 核酸檢測(cè)方法的基本原理一致，均通過熒光定量PCR 技術(shù)進(jìn)行乙肝病人血漿中HBV 病毒載量的檢測(cè)。2 種檢測(cè)試劑的特征比較詳見表1說(shuō)明。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，對(duì)有數(shù)值的HBV DNA 病毒載量數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（log10），通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析不同方法檢測(cè)結(jié)果的差異，用相關(guān)分析法分析不同試劑檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，采用Bland-Altman模型分析不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，試劑比對(duì)用線性分析和χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 種試劑檢測(cè)結(jié)果比較

本研究共收集慢乙肝患者血漿514 例。進(jìn)口試劑結(jié)果檢測(cè)的數(shù)值分布為：“未檢測(cè)到HBV”的標(biāo)本117 例，＜20 IU/mL 的標(biāo)本110 例，20～＞1.7×108IU/mL 區(qū)間的標(biāo)本287 例（其中＞1.7×108IU/mL的標(biāo)本33 例）。將國(guó)產(chǎn)試劑測(cè)試的結(jié)果與進(jìn)口結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析（見表2），結(jié)果顯示：進(jìn)口試劑的陽(yáng)性檢出率為77.2%（397/514），國(guó)產(chǎn)試劑的陽(yáng)性檢出率為78.5%（404/514），說(shuō)明2 種試劑的陽(yáng)性檢出率較接近，沒有明顯的差異（P＞0.05）；兩種試劑間的不符合率（一種檢測(cè)結(jié)果高于檢測(cè)下限/另一種檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)下限）分別為：進(jìn)口試劑7.2%（37/514）和國(guó)產(chǎn)試劑8.6%（44/514），沒有顯著差異（P＞0.05）。進(jìn)口與國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)結(jié)果為“未檢測(cè)到HBV”和＜20 IU/mL 完全一致的標(biāo)本分別為73 例和54 例，2 種試劑同時(shí)高于檢測(cè)下限的樣本為285 例（55.4%）。

表1 2 種試劑的特征比較Table 1 Characterization comparison of 2 reagents

2.2 國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口試劑檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性分析

將國(guó)產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑檢測(cè)結(jié)果中285 例大于檢測(cè)下限的病毒載量值，其中33 例＞1.7×108IU/mL（取對(duì)數(shù)為＞8.23）的標(biāo)本，這33 例標(biāo)本的達(dá)安試劑檢測(cè)結(jié)果值為（8.55±0.39），說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果一致。對(duì)檢測(cè)結(jié)果在20～1.7×108IU/mL 區(qū)間內(nèi)的252 例載量值取對(duì)數(shù)后進(jìn)行相關(guān)性和一致性分析（圖1）。兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.966（P＜0.000 1），表明二者具有較強(qiáng)的相關(guān)性（圖1A）；Bland-Altman 分析兩種方法檢測(cè)病毒載量的差異分析顯示，國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口試劑定量值差值平均值為0.173log10IU/mL，95%可信區(qū)間為（-0.677 9～1.024 0）log10IU/mL。95.6%（241/252）的樣本檢測(cè)值在95%可信區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口試劑具有高度一致性（圖1B）。

表2 2 種試劑檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparison of the results of 2 reagents

圖1 2 種試劑檢測(cè)的相關(guān)性和一致性分析Figure 1 The Correlation and consistency analysis between 2 reagents

本組結(jié)果按照不同病毒載量區(qū)間（低中高）進(jìn)行相關(guān)性分析，國(guó)產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑結(jié)果各組的相關(guān)性均良好；不同病毒載量區(qū)間范圍內(nèi)的相關(guān)性沒有明顯的差別，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)高敏試劑與進(jìn)口試劑間在對(duì)不同病毒載量病人HBV DNA 的檢測(cè)能力上是一致的（如表3所示）。其中，在低濃度區(qū)20～103IU/mL 也具有良好的相關(guān)性，說(shuō)明試劑的檢測(cè)靈敏度較好。

3 討論

HBV DNA 定量檢測(cè)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，為慢性乙型肝炎患者的診療和預(yù)后判斷提供重要的參考依據(jù)［8-10］。結(jié)合傳統(tǒng)HBV 血清標(biāo)志物結(jié)果，對(duì)臨床判定傳染性和指導(dǎo)治療具有重要的參考價(jià)值［11-13］。目前進(jìn)口試劑具有明顯的高特異性和高靈敏度，同時(shí)其準(zhǔn)確性和重復(fù)性也被業(yè)界公認(rèn)為是HBV DNA 定量檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［14］。進(jìn)口試劑具有精密度好、靈敏度高的特點(diǎn)，但是其試劑和儀器成本較高，檢測(cè)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，需要患者提供的血漿量大，在臨床上難于普及，特別是中小型醫(yī)院。同時(shí)試劑本身價(jià)格的昂貴又制約了一部分乙肝病人進(jìn)行乙肝定量定期檢測(cè)的需求?；谥T多因素，開發(fā)國(guó)產(chǎn)試劑，使之進(jìn)一步改善國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)靈敏度、特異性、重復(fù)性等特點(diǎn)具有十足的意義。

表3 2 種試劑有效值在不同病毒載量區(qū)間相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Relativity analysis of 2 reagents in different virus load intervals

在本次比對(duì)實(shí)驗(yàn)中，國(guó)產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑2 種方法的檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)因?qū)嶒?yàn)方法、實(shí)驗(yàn)原理、檢測(cè)靶點(diǎn)等各種差異引起檢測(cè)數(shù)值上差異［15-16］。從方法學(xué)比較可以看出，本實(shí)驗(yàn)的兩種方法均采用自動(dòng)化磁珠提取法獲取病人血漿中的HBV DNA，首先從模板獲取效率上是一致的；在擴(kuò)增試劑上，達(dá)安高敏試劑不僅提高了線性范圍至109IU/mL，在靈敏度上也將檢測(cè)下限降至10 IU/mL，可以給出更寬的檢測(cè)范圍，包括0～20 IU/mL之間的數(shù)值。本次研究平行檢測(cè)了514 例慢乙肝病人血漿標(biāo)本，從進(jìn)口試劑和國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，兩者的陽(yáng)性檢出率基本一致，沒有明顯差異；同時(shí)，兩者的不符合率也比較接近。對(duì)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的有效值進(jìn)行分析可以得出較好的相關(guān)性和一致性，特別在低拷貝區(qū)（20～103IU/mL）相關(guān)性也較好，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)試劑與進(jìn)口試劑的檢測(cè)效率是一致的。

國(guó)產(chǎn)試劑提高了檢測(cè)靈敏度，甚至在載量為0～10 IU/mL 的結(jié)果也能夠給出數(shù)值，但由于其低于試劑盒的靈敏度，只能判斷樣本為陽(yáng)性，其定值結(jié)果也僅供參考。對(duì)比結(jié)果顯示，進(jìn)口試劑檢測(cè)結(jié)果為“未檢測(cè)到HBV”的標(biāo)本在國(guó)產(chǎn)試劑中測(cè)出為＞20 IU/mL 的結(jié)果有4 例，測(cè)出＜20 IU/mL 的結(jié)果有40 例，還不能確定這部分結(jié)果是由于試劑靈敏度差異產(chǎn)生的結(jié)果，也不排除這44 例為假陽(yáng)性結(jié)果，可能存在實(shí)驗(yàn)過程中污染等問題，需要第三方試劑的驗(yàn)證，但是目前還缺乏權(quán)威性的試劑來(lái)對(duì)這種低水平載量的檢測(cè)驗(yàn)證。進(jìn)口試劑檢測(cè)結(jié)果＜20 IU/mL 在達(dá)安基因試劑結(jié)果為“未檢出HBV DNA”的樣本有36 例；進(jìn)口試劑結(jié)果＜20 IU/mL 的標(biāo)本用國(guó)產(chǎn)試劑檢測(cè)＞20 IU/mL 的共20 例，反之的結(jié)果有1 例，這部分結(jié)果說(shuō)明在檢測(cè)下限附近還存在數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果的差異，不排除檢測(cè)過程中的人為誤差或系統(tǒng)本身的誤差造成的這一區(qū)域的結(jié)果差異，但由于這部分國(guó)產(chǎn)試劑的檢測(cè)結(jié)果處于20～100 IU/mL 范圍之間，排除其他指標(biāo)變化的情況對(duì)于臨床來(lái)說(shuō)這種差異不會(huì)造成明顯的治療方案上的改變［2］。

乙肝病毒標(biāo)記物的檢測(cè)可為我國(guó)乙肝患者進(jìn)行早期預(yù)防和治療提供重要的判定依據(jù)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值［17］。現(xiàn)臨床常用試劑檢測(cè)方法還有待提高，盡管進(jìn)口試劑具有開放性，檢測(cè)準(zhǔn)確、精密度高等優(yōu)勢(shì)，但因科室發(fā)展需要和經(jīng)濟(jì)水平受限等原因，目前使用國(guó)產(chǎn)試劑的臨床單位較為普遍。目前國(guó)產(chǎn)試劑也在努力開發(fā)更加高靈敏度、高特異性的試劑縮短與進(jìn)口試劑之間的差距從而滿足臨床需求，這有助于提高臨床對(duì)乙型肝炎的早期診斷，也有利于國(guó)家衛(wèi)生事業(yè)的蓬勃發(fā)展。在本次實(shí)驗(yàn)中，國(guó)產(chǎn)試劑在低拷貝區(qū)與進(jìn)口試劑的檢測(cè)差異在逐漸減少，也體現(xiàn)出了國(guó)產(chǎn)試劑在操作時(shí)長(zhǎng)的控制和人為誤差的控制上的提高，這極大的提高了臨床檢驗(yàn)的效率，降低了人為操作誤差所帶來(lái)的誤判。由于本文病例的選擇并非完全隨機(jī)，還需要通過大樣本、多中心的數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證確切的結(jié)論。