雙靶標(biāo)高敏HBV DNA檢測技術(shù)在HBeAg陰性患者臨床診斷中應(yīng)用

馮磊

乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是乙型肝炎病毒的簡稱，為臨床上引起乙型肝炎的病原體，其感染已呈世界性流行并成為全球性的公共衛(wèi)生問題［1-2］。由病毒引起的乙型肝炎具有發(fā)病慢、傳染性強、傳播途徑多樣等特點，多數(shù)乙肝病毒攜帶者在臨床表現(xiàn)上呈現(xiàn)不出明顯癥狀，因此臨床診斷上具有一定的困難［3-4］。目前，臨床診斷HBV 感染主要通過血清特異性抗原抗體免疫檢測和HBV DNA 檢測來實現(xiàn)。隨著新型抗病毒藥物不斷問世，抗病毒藥物得到廣泛應(yīng)用，加之乙型肝炎疫苗免疫普及，感染HBV 人口老齡化等，急性HBV 感染明顯減少，HBeAg 陰性慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的比例有所上升［5-7］。研究表明，HBeAg 陰性CHB 是一種特殊的CHB 臨床類型，主要誘因為HBV 變異和（或）宿主免疫壓力，與HBeAg 陽性CHB 比較，具有隱匿性強，臨床癥狀極不明顯的特點［2，6］。通常，HBeAg 陰性CHB 患者年齡更大，病史更長，肝臟纖維化程度更為嚴(yán)重，而且在抗病毒的治療中應(yīng)答率對比其他類型患者更低，所以治療效果多不理想，更易進(jìn)展為肝硬化和原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［8-10］。故而找到一種更加有效的檢測方法，對于判斷病毒復(fù)制水平、評估疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)、選擇有效治療方案具有重大意義。本文比較雙靶標(biāo)高敏乙肝檢測技術(shù)與傳統(tǒng)普敏乙肝檢測技術(shù)對HBeAg 陰性HBV 感染者檢出率之差異，探討雙靶標(biāo)高敏乙肝DNA 檢測在診治中的優(yōu)勢。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月至2019年7月在本院就診的180 例血清HBeAg 陰性HBV 感染患者為研究對象。所有患者，包括乙型肝炎肝硬化代償期、慢性乙型病毒性肝炎患者均滿足《2015年慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)；研究對象篩選過程中排除血液標(biāo)本中出現(xiàn)溶血、脂血者，其中男性110 例，女性70 例，年齡21～90 歲，平均年齡（47.92±13.42）歲。所有患者及家屬均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取與PCR 反應(yīng)體系構(gòu)建

核酸提取或純化試劑（DA622）（購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）的預(yù)封裝96 孔板中加入4 μL 內(nèi)標(biāo)液、20 μL 蛋白酶K、200 μL 血清樣本和陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品及4個陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品，將其放入Smart32 半自動核酸提取儀（購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），按核酸提取試劑盒說明書設(shè)置提取程序，運行結(jié)束后，將所得核酸（40 μL/孔）加入PCR 反應(yīng)管中（含配置好的反應(yīng)液20 μL）。PCR 擴(kuò)增儀為ABI Prism 7300 儀器，均購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.2.2 高敏核酸檢測方法

采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）（DA-Z051，雙靶標(biāo)），擴(kuò)增程序設(shè)置為：50℃2 min，1 個循環(huán)；95℃15 min，1 個循環(huán)；94℃15 s，55℃45 s，45 個循環(huán)。雙靶標(biāo)高敏試劑最低定量檢測限20 IU/mL，檢測靈敏度10 IU/mL。

1.2.3 普敏法核酸提取

核酸提取試劑采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR熒光探針法）（DA0030），擴(kuò)增程序設(shè)置為：93℃2 min，1 個循環(huán)；93℃45 s，55℃60 s，10 個循環(huán)；93℃30 s，55℃45 s，30 個循環(huán)。普敏法最低定量檢測限100 IU/mL，檢測靈敏度30 IU/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布計量資料用（）表示，采用t檢驗；非正態(tài)計量資料比較，采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以n或（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 種試劑的檢測結(jié)果

雙靶標(biāo)高敏乙肝檢測法與普敏檢測法180 例患者血清HBV DNA 載量情況，見表1。

2.2 2 種不同方法檢測HBV DNA 陽性率比較

雙靶標(biāo)高敏乙肝檢測法的陽性率顯著高于普敏法，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

2.3 2 種不同方法檢測HBV DNA 水平比較

76 例HBeAg 陰性患者中兩種不同的方法對不同年齡、性別的患者HBV-DNA 水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；臨床診斷慢性乙型肝炎患者HBV-DNA 水平顯著高于臨床診斷非活動性HBsAg 攜帶者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見表3）。

表1 2 種試劑測定HBV DNA 結(jié)果（IU/mL）Table 1 Determination of HBV DNA results by 2 reagents（IU/mL）

表2 2 種試劑檢測HBV DNA 陽性率比較［n（%）］Table 2 Comparison of HBV DNA positive ratesdetected by 2 reagents［n（%）］

3 討論

隨著生活水平的不斷提升，乙肝的發(fā)病率也有所上升，且因其隱匿性強，一般未見有明顯的臨床表現(xiàn)，多為體檢發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時常已經(jīng)發(fā)展為嚴(yán)重的肝臟疾病，如肝硬化、肝癌等，故而能在疾病發(fā)展早期就可敏銳發(fā)現(xiàn)其發(fā)病趨勢將有效控制乙肝發(fā)病率。HBV DNA 定量檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，主要為慢性HBV 感染患者判斷其體內(nèi)病毒的復(fù)制水平即活躍程度，也是最直接、最可靠的指標(biāo)，并同時為醫(yī)生診療和預(yù)后判斷提供重要的參考依據(jù)［11］。

表3 2 種試劑檢測HBV DNA 水平比較［n（%）］Table 3 Comparison of HBV DNA levels detected by 2 reagents［n（%）］

運用熒光定量PCR 技術(shù)檢測HBV DNA 具有精密度好、靈敏度高、特異性強等特點［12］。在目前國內(nèi)臨床上使用的HBV DNA 熒光定量PCR 試劑種類很多，各類試劑之間的性能參數(shù)如靈敏度、特異性、線性范圍等方面均存有差異［17-18］。

高敏HBV DNA 檢測分析采用更智能的方式對血液標(biāo)本實施核酸提取、純化，其回收率較高，且重復(fù)性也較好，人為誤差也有所降低使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確；且高敏法使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，所以在檢測樣本的同時提取、擴(kuò)增，可消除管間差異使檢測結(jié)果更為可靠。普敏乙肝檢測方法在臨床中的應(yīng)用范圍廣，但回收率偏低、重復(fù)性差，并且費時費力，容易造成人為誤差，導(dǎo)致普敏法對于病毒定量檢測的準(zhǔn)確性偏低，特別在低載量病毒核酸分析中定量分析的效果更差［13-15］。C 區(qū)突變或S 區(qū)突變可能導(dǎo)致e 抗原或表面抗原表達(dá)過低或不表達(dá)，造成免疫學(xué)相關(guān)檢測陰性，但核酸可以檢測到。雙靶標(biāo)高敏試劑是針對C 區(qū)和S 區(qū)設(shè)計雙引探，對病毒變異珠的檢出能力增強，核酸提取、純化、回收率較高，核酸純度高，且重復(fù)性也較好，相對而言，對低病毒載量樣本檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確［14，16-18］。

本研究顯示，180 例血清HBeAg 陰性患者中，雙靶標(biāo)高敏法檢測出陽性103 例，陰性77 例，陽性檢出率52.2%；普敏法可檢測出35 例陽性，145 例陰性，陽性檢出率19.4%。兩種研究方法的對比中，雙靶標(biāo)高敏法的檢出率顯著高于后者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），這與雙靶標(biāo)高敏試劑可同時檢測兩區(qū)變化有直接聯(lián)系。雙靶標(biāo)高敏法在臨床診斷慢性乙型肝炎患者HBV DNA 水平顯著高于臨床診斷非活動性HBsAg 攜帶者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），即雙靶標(biāo)高敏檢測法可更為準(zhǔn)確的檢測出HBeAg 陰性乙肝肝硬化患者的低載量病毒進(jìn)而準(zhǔn)確指導(dǎo)醫(yī)生用藥，盡早精確控制病情，延緩肝臟疾病的不良事件的發(fā)生發(fā)展。該研究的結(jié)果與以往的研究［19-20］結(jié)果一致，具有一定的科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，雙靶標(biāo)高敏檢測法用于血清HBV DNA 定量檢測準(zhǔn)確性更高，較普敏法而言，超敏定量分析法對病毒檢測精確度更佳，及時有效，漏檢率更低，保證檢測結(jié)果的正確性，判斷患者是否感染有病毒，可作為篩查，治療起點，療效評估，治療終點的評判依據(jù)，其臨床應(yīng)用價值較高。由于本文病例的選擇并非完全隨機，因此，未來還需要通過大樣本、多中心的數(shù)據(jù)來驗證確切的結(jié)論。