高敏與普通熒光定量PCR技術(shù)在慢乙肝患者抗病毒療效監(jiān)測(cè)中的對(duì)比研究

盧建華 楊莉 趙召霞 李芊璘 李敏然 劉玉珍 戴二黑 陳秀麗

近年來，世界衛(wèi)生組織、美國肝病研究學(xué)會(huì)（American Association for the study of liver disease，AASLD）、歐洲肝臟研究協(xié)會(huì)（European Association for the Study of the Liver，EASL）、亞太肝病研究學(xué)會(huì)（Asia Pacific association for the study of liver，APASL）以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)等制訂的慢性乙型肝炎防治指南均推薦采用靈敏度和精確度高的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR）法，最低檢測(cè)下限為10～15 IU/mL［1-4］。然而，目前國內(nèi)各單位常用的HBV DNA定量檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度在100～1 000 IU/mL之間，往往不能很好地滿足臨床對(duì)CHB 管理的需要。高靈敏度的HBV DNA 試劑推廣速度緩慢的原因除了進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴外，還包括臨床對(duì)高靈敏度的HBV DNA 檢測(cè)的臨床意義了解不深刻。本研究選取141 份接受乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）抗病毒治療慢性患者普通PCR 檢測(cè)HBV DNA 陰性標(biāo)本，采用高靈敏度的HBV DNA試劑進(jìn)行復(fù)檢，分析低值HBV DNA 的分布特征，并探索高靈敏度HBV DNA 檢測(cè)在慢乙肝患者抗病毒療效監(jiān)測(cè)中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

49 例初治CHB 患者，均為2017年1月至2019年6月在石家莊市第五醫(yī)院就診患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡為18 周歲及以上，性別不限；HBsAg 陽性至少6 個(gè)月；未接受過任何治療的HBeAg 陽性CHB患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染的患者；合并自身免疫性疾病的患者；其他原因所致的慢性肝病患者；肝硬化患者；原發(fā)性肝癌患者；妊娠或哺乳期患者；合并其他嚴(yán)重的慢性疾病患者；目前正在參與其它臨床試驗(yàn)研究患者。本研究通過了石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 治療方法

所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》［1］中抗病毒治療的適應(yīng)證。抗病毒治療方案：恩替卡韋（蘇州東瑞制藥有限公司）0.5 mg，每日一次。

1.3 觀察指標(biāo)

治療開始前（基線）、治療開始后4、12、24、36、48 周檢測(cè)HBV 血清學(xué)標(biāo)志物和HBV DNA 定量水平，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartic aminotransferase，AST）。采用高敏PCR 試劑對(duì)141份采用普通PCR 檢測(cè)HBV DNA 定量結(jié)果陰性（＜500 IU/mL）的標(biāo)本，進(jìn)行復(fù)查。

1.3.1 主要儀器與試劑

DA3200 全自動(dòng)核酸提取儀購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，ABI7500 型熒光定量PCR儀購自美國Life Technologies 公司，低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；HBV DNA 普通檢測(cè)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，其說明書聲明的靈敏度為500 IU/mL，線性范圍為500～5.0×108IU/mL。HBV DNA 高敏檢測(cè)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，其說明書聲明的靈敏度為20 IU/mL，線性范圍為20～1.0×109IU/mL。autolumo A2000plus 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。H7600 型全自動(dòng)生化分析儀購自日本日立公司。

1.3.2 血清HBV DNA 檢測(cè)

采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)血清HBV DNA含量。

1.3.3 HBV 血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)

采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)定量檢測(cè)血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 水平。

1.3.4 肝功能檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將研究對(duì)象的臨床數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 表格中，采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）或百分率（%）表示，組間比較用卡方分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高敏PCR 與普通PCR 檢測(cè)CHB 患者血清HBV DNA 結(jié)果比較

141 份采用普通PCR 檢測(cè)結(jié)果陰性CHB 患者標(biāo)本中，采用高敏PCR 試劑進(jìn)行復(fù)查，根據(jù)血清HBV DNA 定量水平IU/mL，存在以下5 種結(jié)果，即＞500、20～500、10～20、＜10 IU/mL 和陰性，比例分別為13.5%、31.9%、18.4%、30.5%和5.7%，見表1。

表1 高敏PCR 與普通PCR 檢測(cè)CHB 患者血清HBV DNA 結(jié)果比較［n（%）］Table 1 Comparison of serum HBV DNA results between high sensitivity and normal PCR in CHB patients［n（%）］

2.2 CHB 患者血清HBV DNA 載量與ALT、AST水平的關(guān)系

按照高敏PCR 試劑血清HBV DNA 的檢測(cè)結(jié)果分組，各組ALT、AST 的狀況見表2。隨著血清HBV DNA 水平增高各組ALT 水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HBV DNA陰性組、＜10 IU/mL 組和10～20 IU/mL 組與HBV DNA＞500 IU/mL 組CHB 患者AST 水平相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.010、0.012、0.023）。其余各組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著血清HBV DNA 水平增高，各組ALT、AST 異常升高率也存在逐漸增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 CHB 患者血清HBV DNA 與ALT、AST 的關(guān)系［（±s）］Table 2 Relationship between serum HBV DNA and ALT and AST in CHB patients［（±s）］

表2 CHB 患者血清HBV DNA 與ALT、AST 的關(guān)系［（±s）］Table 2 Relationship between serum HBV DNA and ALT and AST in CHB patients［（±s）］

與＞500 IU/mL 組比較，P<0.05。

HBV DNA水平（IU/mL）＞500 20～500 10～20＜10陰性標(biāo)本數(shù)19 45 26 43 8 ALT 狀況（U/mL）異常升高8（42.1）10（22.2）6（23.1）4（9.3）1（12.5）水平43.5±31.4 29.0±15.9 26.5±12.0 30.6±29.5 25.5±9.7 AST 狀況（U/mL）異常升高6（31.6）9（20.0）2（7.7）6（13.9）0（0）水平37.4±18.3 30.7±15.8 28.2±8.1a 28.1±10.8a 22.8±3.7a

2.3 CHB 患者血清HBV DNA 與血清HBV 標(biāo)志物的關(guān)系

隨著血清HBV DNA 水平逐漸降低，各組血清HBeAg 陽性率和水平也存在逐漸降低的趨勢(shì)。其中，HBV DNA 陰性組血清HBeAg 陽性率顯著低于10～20 IU/mL 和＞500 IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.033、0.006），但各組HBeAg 水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 CHB 患者血清HBV DNA 載量與HBeAg 和抗-HBc狀況的關(guān)系［（±s）］Table 3 Relationship between serum HBV DNA load and HBeAg and anti-hbc status in CHB patients［（±s）］

表3 CHB 患者血清HBV DNA 載量與HBeAg 和抗-HBc狀況的關(guān)系［（±s）］Table 3 Relationship between serum HBV DNA load and HBeAg and anti-hbc status in CHB patients［（±s）］

與HBV DNA 陰性組比較，P<0.05。

HBV DNA水平（IU/ml）＞500 20～500 10～20＜10陰性標(biāo)本數(shù)（n）19 45 26 43 8 HBeAg 狀況陽性16（84.2）a 29（64.4）19（73.1）a 26（60.5）2（25.0）水平136.6±221.9 34.7±112.1 5.5±11.8 43.6±232.5 4.0±7.7抗-HBc 狀況陽性19（100.0）45（100.0）26（100.0）43（100.0）8（100.0）水平83.4±40.4 91.2±46.7 107.4±38.2 104.2±50.5 78.3±50.5

3 討論

本文對(duì)比了同一公司的普通和高敏乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示141 份采用普通HBV 核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果陰性（＜500 IU/mL）的CHB 患者標(biāo)本中，采用高敏PCR 試劑盒檢測(cè)僅有8 份（5.7%）為陰性。HBV 復(fù)制的一個(gè)最顯著的特點(diǎn)是經(jīng)mRNA 中間體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，這一過程由于缺乏校對(duì)酶的作用而容易發(fā)生錯(cuò)誤，核苷酸替代率約為1～3×10-5/nt/年［6］。HBV 變異率高于其他DNA病毒4 個(gè)數(shù)量級(jí)，而低于RNA 病毒1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)。普通PCR 試劑一般采用S 或C 區(qū)等保守段基因進(jìn)行單靶標(biāo)擴(kuò)增，因此，不可避免的存在定量值偏低甚至漏檢可能［7］。一項(xiàng)179 例HBV 臨床樣本研究顯示，6.1%（11 例）Roche CAP/CTM 定量值顯著低于（差值≥1.0 log10 IU）雙靶標(biāo)擴(kuò)增定量值，其中4 例在nt1827-nt1970 位突變，位于Roche試劑擴(kuò)增靶區(qū)［8］。有研究顯示雙靶標(biāo)擴(kuò)增曲線熒光值高于單靶標(biāo)，CT 值略有提前［9］。本文研究結(jié)果再次證實(shí)了這一結(jié)論，有19 份（13.5%）檢測(cè)結(jié)果高于500 IU/mL，范圍在696～41 500 IU/mL之間。

本文進(jìn)一步分析了這些低病毒載量（＜500 IU/mL）標(biāo)本的臨床特征，隨著血清HBV DNA 水平的逐漸增高，各組ALT、AST 水平和異常升高率也存在逐漸增加的趨勢(shì)，但是僅僅各組AST 水平差異有顯著意義（P<0.05）。而且，隨著血清HBV DNA水平逐漸降低，各組血清HBeAg 陽性率和水平也存在逐漸降低的趨勢(shì)。其中，HBV DNA 陰性組血清HBeAg 陽性率顯著低于10～20 IU/mL 組和＞500 IU/mL 組（P<0.05），提示高靈敏度的HBV DNA 定量檢測(cè)結(jié)果在CHB 患者抗病毒治療監(jiān)測(cè)中發(fā)揮的重要作用。HBV DNA 定量檢測(cè)主要用于判斷慢性HBV 感染的病毒復(fù)制水平，可用于抗病毒治療適應(yīng)證的選擇及療效的判斷［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道治療早期HBV DNA 是核苷（酸）類藥物療效的預(yù)測(cè)因子，治療第24 周時(shí)的HBV DNA 值可預(yù)測(cè)長(zhǎng)期治療的VR 率，第24 周時(shí)HBV DNA ＜2.3 log10IU/mL的患者3年VR 達(dá)到98.6%，治療24 周時(shí)HBV DNA 值可預(yù)測(cè)HBeAg 清除率［10］，第24 周時(shí)HBV DNA＜63 IU/mL 的 患 者2年HBeAg 清 除 率 達(dá)43.2%［11］。而且，對(duì)抗病毒治療耐藥的最初臨床表現(xiàn)是病毒學(xué)突破，病毒學(xué)突破可早于生化學(xué)數(shù)月甚至數(shù)年［12-13］。所有這些研究結(jié)果均提示靈敏度和精確度高的HBV DNA 檢測(cè)方法的重要性和必要性。普通PCR 檢測(cè)方法由于靈敏度差，一般檢測(cè)下限僅為500 IU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床慢乙肝管理的需求，因此，需要大力推廣高敏HBV DNA定量檢測(cè)技術(shù)。

本文發(fā)現(xiàn)了一些非常有臨床價(jià)值的結(jié)果，但由于例數(shù)偏少，還需要多中心、大樣本臨床研究以及連續(xù)長(zhǎng)期隨訪加以證實(shí)。本院牽頭7 個(gè)臨床研究中心，已經(jīng)開展了為期2年的恩替卡韋抗病毒治療隊(duì)列研究，期望對(duì)高靈敏度HBV DNA定量檢測(cè)技術(shù)的臨床價(jià)值有更深入的探討和評(píng)價(jià)。