乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光PCR超敏檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)

夏喬 廖麗麗 董志強(qiáng) 楊鴻輝 蔣析文

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球發(fā)病率最高的傳染病之一［1］，全球的乙肝患者多達(dá)3.5～4 億。我國(guó)是乙肝高發(fā)國(guó)，約有9 300 萬左右的乙肝病毒攜帶者，約占我國(guó)總?cè)丝跀?shù)的8%～10%［2］。目前，臨床上主要使用抗體、抗原和核酸聯(lián)合檢測(cè)的方法對(duì)乙型肝炎患者進(jìn)行診斷和治療管理［3］。其中HBV DNA 載量的檢測(cè)在HBV感染的早期診治，判斷疾病活動(dòng)性、制定抗病毒治療方案、療效檢測(cè)以及判斷治療終點(diǎn)中均起著至關(guān)重要的作用［4］。我國(guó)發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南推薦使用高敏檢測(cè)方法檢測(cè)HBV DNA 載量，亞太肝病研究學(xué)會(huì)和歐洲肝病研究學(xué)會(huì)均明確要求檢測(cè)方法的靈敏度應(yīng)達(dá)到10～15 IU/mL，高靈敏度檢測(cè)方法能夠確診低病毒載量的乙肝患者和抗病毒治療過程中的病毒清除速率，也有助于發(fā)現(xiàn)隱匿性乙肝感染［5-6］。因此，建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的HBV DNA 檢測(cè)方法，對(duì)臨床上乙型肝炎的預(yù)防和控制具有重要的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品或參考品

乙肝標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家參考品購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙肝分型參考品HBV Worldwide AccuSetTMPerformance Panel 購自美國(guó)Sera Care Life Science 公司。

1.1.2 臨床樣本

樣本收集自昆明市第三人民醫(yī)院完成日常檢測(cè)項(xiàng)目后的剩余樣本。使用無菌注射器進(jìn)行采集后，收集于無菌離心管中，室溫放置不超過4 h，待樣本自行析出血清，完成檢測(cè)后的剩余樣本保存在-20℃待測(cè)。主要為乙型肝炎患者或其核酸檢測(cè)陽性樣本，HBV DNA 濃度在0～1×109IU/mL 范圍內(nèi)均勻分布。

1.1.3 主要試劑和儀器

引物、探針、熱啟動(dòng)Taq DNA 聚合酶、病毒核酸提取或純化試劑盒和Smart32 核酸提取儀均由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供；UDG 酶、dNTPs 購自Promega 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI Prism 7500）購自美國(guó)ABI 公司。

臨床評(píng)價(jià)對(duì)比試劑（以下簡(jiǎn)稱某國(guó)產(chǎn)獲證試劑）靈敏度10 IU/mL，線性范圍30～1×109IU/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì)

應(yīng)用Bioedit 軟件對(duì)GenBank 中登錄的HBV 乙型肝炎病毒的S 區(qū)段和C 區(qū)段序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用Primer 5.0 軟件分別在各自的高度保守序列內(nèi)進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。S 區(qū)段的上游引物HBV SF：5′-GTCCTGGCTATCGCTGGATGTG-3′，下游引物HBV S-R：5′-CCAACAAGAAGATGAGGCATA GCA-3′，探針HBV S-P：5′-CCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCT-3′；C 區(qū)段的上游引物HBV CF：5′- TTCGCACTCCTCCTGCTT-3′，下游引物HBV C-R：5′-CACCTTATGAGTCCAAGGGA-3′，探針HBV C-P：5′- ACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTC-3′。引物和探針均由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司合成。

1.2.2 核酸提取

標(biāo)準(zhǔn)品、參考品和臨床樣本的核酸提取，均使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒（粵穗械備20170583 號(hào)），提取步驟參照試劑盒說明書。

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化

熒光定量PCR 反應(yīng)體系如下：1×PCR Buffer、熱啟動(dòng)Taq 酶5 U、UDG 酶5 U、上下游引物（20～30 μM）、探針（2～5 μM），配制成20 μL 的PCR mix，加入40 μL 提取后的HBV DNA 模板，總體積60 μL。反應(yīng)程序：50℃2 min；95℃15 min；94℃15 s，退火45 s，45 個(gè)循環(huán)；40℃20 s。退火延伸時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。以收集到HBV 陽性臨床樣本所提取的核酸為模板，不同退火溫度52℃～60℃下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)，同時(shí)應(yīng)用矩陣優(yōu)勢(shì)法對(duì)熒光RT-PCR 體系中探針濃度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到實(shí)時(shí)熒光PCR 的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)。

1.2.4 定量參考品的制備

選取臨床上收集的乙型肝炎病毒陽性血清或血漿，使用中國(guó)食品藥品檢定研究院的乙型肝炎病毒核酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定。用陰性血清或血漿根據(jù)標(biāo)定濃度將收集的源漿分別稀釋到5.0×106，5.0×105，5.0×104，5.0×103IU/mL，制備成定量參考品，檢測(cè)其相關(guān)系數(shù)，要求相關(guān)系數(shù)r2≥0.98。

1.2.5 最低檢出限的確定

使用陰性血清或血漿稀釋中國(guó)食品藥品檢定研究院的乙型肝炎病毒核酸國(guó)家靈敏度參考品到20、10、5、2.5 IU/mL，然后分別檢測(cè)各濃度陽性檢出率，用Origin 的Sigmoidal Fit 的方法擬合成曲線，根據(jù)軟件給出的曲線公式計(jì)算本試劑盒的最低檢出限。

1.2.6 最低定量限的確定

使用陰性血清或血漿稀釋中國(guó)食品藥品檢定研究院的乙型肝炎病毒核酸國(guó)家靈敏度參考品到20 IU/mL，重復(fù)20 次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果濃度對(duì)數(shù)值與理論對(duì)數(shù)值的差異，要求所有樣本實(shí)測(cè)值與理論值的對(duì)數(shù)值差值在± 0.5 Log10IU/mL以內(nèi)。

1.2.7 線性范圍的確認(rèn)

選取臨床上收集的HBV 高值樣本（1×109IU/mL 以上），使用本超敏試劑對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定。用小牛血清將標(biāo)定的源漿10 倍梯度稀釋到1×109，1×108，1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，20 IU/mL，計(jì)算檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值其與理論濃度對(duì)數(shù)值的相關(guān)系數(shù)，以確定本試劑盒的線性范圍，相關(guān)系數(shù)r2≥0.98 則合格。

1.2.8 批內(nèi)和批間精密度檢測(cè)

將臨床上收集的高值混合樣本（1×108IU/mL以上）混勻后制備成精密度參考品Hc1（1×108IU/mL 左右），Mc1（1×103IU/mL 左右），Lc1（使用小牛血清稀釋HBV 標(biāo)準(zhǔn)品到200 IU/mL），每個(gè)參考品重復(fù)20 次測(cè)試，計(jì)算檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值的變異系數(shù)（CV 值），CV≤5%則批內(nèi)精密度合格。

將臨床上收集的另一份高值混合樣本（1×108IU/mL 以上）混勻后制備成精密度參考品Hc2（1×108IU/mL 左右），Mc2（1×103IU/mL 左右），Lc2（使用小牛血清稀釋HBV 標(biāo)準(zhǔn)品到200 IU/mL），每個(gè)參考品重復(fù)5 次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)三個(gè)參考品各重復(fù)4 次測(cè)試，計(jì)算檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值的變異系數(shù)，CV≤5%則批間精密度合格。

1.2.9 檢測(cè)型別的確認(rèn)

將購自美國(guó)Sera Care Life Science 公司的乙肝分型參考品HBV Worldwide AccuSetTM Performance Panel（包含A、B、C、D、E、F、H，7 種型別）使用小牛血清稀釋100 倍后進(jìn)行檢測(cè)，確定不同型別的陰陽性。

1.2.10 準(zhǔn)確度的確定

使用HBV 國(guó)家參考品中的陽性參考品P1-P9，陰性參考品N1-N8，檢測(cè)其陰陽性，確定本試劑盒的準(zhǔn)確度。

1.2.11 臨床樣本評(píng)估試驗(yàn)

收集自昆明市第三人民醫(yī)院完成日常檢測(cè)項(xiàng)目后的195 例剩余樣本。分別使用本研究的超敏試劑和某國(guó)產(chǎn)獲證試劑進(jìn)行平行檢測(cè)，操作方法參照試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，通過SPSS 19.0 軟件和Bland-Altman 模型分析兩組數(shù)據(jù)的陰陽性符合率及檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用Medcalc 軟件進(jìn)行繪制兩種方法差值對(duì)均值的散點(diǎn)圖，并用Medcalc 軟件的Passing-Bablok 回歸法作兩種檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)線性回歸分析，用回歸分析驗(yàn)證兩種試劑結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果

2.1 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化

以收集到HBV 陽性臨床樣本所提取的核酸為模板進(jìn)行熒光PCR 擴(kuò)增，經(jīng)矩陣法優(yōu)化篩選，以獲得最佳引物和探針濃度。引物探針的最佳濃度為：S 基因上下游引物25 μM，探針3 μM，C 基因上下游引物25 μM、探針2 μM，總體系60 μL。最佳擴(kuò)增條件確定為：50℃2 min，95℃15 min；94℃15 s，55℃45 s，45 個(gè)循環(huán)；40℃20 s。退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。

2.2 定量參考品的制備

選取臨床上收集的乙型肝炎病毒陽性血漿，用HBV 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定后，使用陰性血漿根據(jù)標(biāo)定濃度將其分別稀釋到5.0×106，5.0×105，5.0×104，5.0×103IU/mL，制備成定量參考品，檢測(cè)結(jié)果見圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2=0.999，斜率slope=-3.328。

圖1 定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 The results of quantitative standard amplification linear curve

2.3 最低檢出限的確定

使用小牛血清稀釋中國(guó)食品藥品檢定研究院的乙型肝炎病毒核酸國(guó)家靈敏度參考品到20、10、5、2.5 IU/mL，分別檢測(cè)各濃度陽性檢出率，見表1。用Origin 的Sigmoidal Fit 的方法擬合成曲線，根據(jù)軟件給出的曲線公式計(jì)算本試劑盒的最低檢出限，見圖2。確定本試劑盒的靈敏度為10 IU/mL。

表1 HBV 靈敏度的確定試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果［n（%）］Table 1 The results of sensitivity determination test［n（%）］

圖2 HBV 靈敏度的確定試驗(yàn)曲線擬合結(jié)果Figure 2 Sensitivity determination test curve fitting result

2.4 最低定量限的確認(rèn)

使用小牛血清稀釋HBV 國(guó)家參考品中的靈敏度參考品到20 IU/mL，重復(fù)20 個(gè)測(cè)試，定量結(jié)果對(duì)數(shù)值在（1.3±0.5）Log10IU/mL 范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果平均值為15.41 IU/mL，確定本試劑盒的最低定量限為20 IU/mL，見圖3。

圖3 最低定量檢測(cè)限的確定擴(kuò)增曲線Figure 3 Determination of the minimum quantitative detection limit

2.5 線性范圍的確認(rèn)

選取臨床上收集的HBV 高值樣本（1×109IU/mL 以上），使用本超敏試劑對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定后，使用小牛血清將其10 倍梯度稀釋到1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、20 IU/mL，檢測(cè)結(jié)果的對(duì)數(shù)值分別為8.817、7.874、6.977、5.812、4.973、3.881、2.597、2.110、1.424 Log10IU/mL。檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值其與理論濃度對(duì)數(shù)值的相關(guān)系數(shù)r2=0.994，確定本試劑盒的可測(cè)定線性范圍為20～1×109IU/mL，見圖4。

圖4 高值臨床樣本10 倍梯度稀釋線性范圍擴(kuò)增曲線Figure 4 Linear range amplification curve of 10-fold gradient dilution for clinical samples

2.6 批內(nèi)與批間精密度的確定

將三個(gè)批內(nèi)精密度參考品（Hc1，Mc1，Lc1）各重復(fù)20 個(gè)測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值的CV 值分別為0.88%，2.53%和3.86%，見圖5、圖6、圖7。批內(nèi)重復(fù)性良好。

圖5 批內(nèi)精密度樣本Hc1 擴(kuò)增曲線Figure 5 Intra-assay precision amplification curve of Hc1 sample

圖6 批內(nèi)精密度樣本Mc1 擴(kuò)增曲線Figure 6 Intra-assay precision amplification curve of Mc1 sample

圖7 批內(nèi)精密度樣本Lc1 擴(kuò)增曲線Figure 7 Intra-assay precision amplification curve of Lc1 sample

將3 個(gè)批間精密度參考品（Hc2，Mc2，Lc2）重復(fù)5 次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)3 個(gè)參考品各重復(fù)4 個(gè)測(cè)試，每個(gè)參考品檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值的CV 值分別為2.10%，3.70%和4.22%，批間重復(fù)性良好，見表2。

2.7 不同基因型的覆蓋

將乙肝分型參考品HBV Worldwide Accu-SetTM Performance Panel 中的7 種基因型參考品用小牛血清稀釋100 倍后使用超敏試劑進(jìn)行檢測(cè)，A、B、C、D、E、F、H，7 種亞型檢測(cè)結(jié)果全部為陽性。

2.8 準(zhǔn)確度的確認(rèn)

使用超敏試劑檢測(cè)HBV 國(guó)家參考品中的9 份陽性參考品檢測(cè)結(jié)果全為陽性；8 份陰性參考品全部為陰性，見表3。本研究的超敏試劑的準(zhǔn)確度為100%。

2.9 臨床樣本評(píng)估試驗(yàn)

使用超敏試劑與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑平行檢測(cè)臨床收集的195 例樣本，其中，超敏試劑檢測(cè)出183 例陽性、12 例陰性；某國(guó)產(chǎn)獲證試劑檢測(cè)183例陽性、12 例陰性。兩者陰陽性不符合樣本數(shù)2例。與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑相比，超敏試劑檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率為99.45%，陰性符合率為91.67%，總符合率為98.97%。Kappa 檢驗(yàn)一致性分析結(jié)果顯示，Kappa 值為0.911 2（P<0.05），一致性較好，見表4。

對(duì)符合2 個(gè)檢測(cè)試劑線性范圍內(nèi)168 例樣本的檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)后進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.979 1，P<0.000 1，表明兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖9）。定值差異分析結(jié)果顯示，超敏試劑與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑定量值差值的平均值為0.256 Log10IU/mL，95%界值為（-0.665～1.177）Log10IU/mL。95%（161/168）的樣本檢測(cè)結(jié)果在95%可信區(qū)間內(nèi)，表明本研究的超敏試劑與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑具有較高的一致性，見圖8。

表2 批間精密度檢測(cè)結(jié)果及變異系數(shù)Table 2 Inter-assay precision test results and coefficient of variation

表3 HBV 國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果Table 3 HBV national reference test results

3 討論

本研究在GeneBank 上進(jìn)行序列對(duì)比，在HBV 基因組的S 區(qū)和C 區(qū)兩個(gè)高度保守的區(qū)域，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物和探針，應(yīng)用Taqman 熒光PCR 技術(shù)建立了一種HBV DNA 超敏檢測(cè)的方法，與其他國(guó)產(chǎn)試劑的單靶標(biāo)設(shè)計(jì)相比，本研究的雙靶標(biāo)設(shè)計(jì)能有效防止因基因突變導(dǎo)致的漏檢，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)，防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。與此同時(shí)，本研究還采用了達(dá)安獨(dú)有的Dprobe 探針技術(shù)，與普通的Taq-man 探針技術(shù)相比，Dprobe 探針的本底信號(hào)更低，信噪比更高，能有效提高試劑盒的檢測(cè)靈敏度。本研究的超敏試劑的靈敏度達(dá)到10 IU/mL，線性范圍20～2×108IU/mL，批內(nèi)和批間精密度變異系數(shù)在5%以內(nèi)，檢測(cè)型別包含A、B、C、D、E、F、H，其檢測(cè)靈敏度等性能指標(biāo)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際同類試劑盒水平。本研究還收集了195 臨床樣本對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)，與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑相比，超敏試劑的陽性符合率為99.45%，陰性符合率為91.67%，總符合率為98.97%，Kappa 檢驗(yàn)一致性分析表明，超敏試劑與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑檢測(cè)結(jié)果一致性較好（Kappa 值為0.911 2，P<0.05，95%置信區(qū)間為0.789 1～1.033 3）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，本方法與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑具有顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r=0.979 1，回歸方程：Y=0.903 6X+0.226 0）。

表4 超敏試劑與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑的臨床樣本評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Evaluation of clinical samples of hypersensitive reagents and a domestic certified reagent

圖8 超敏試劑與某國(guó)產(chǎn)獲證試劑相關(guān)性和一致性分析結(jié)果Figure 8 Correlation and consistency analysis results of hypersensitive reagents and a domestic certified reagent

以上結(jié)果表明，本研究成功建立了一種HBV高敏檢測(cè)的方法，其性能指標(biāo)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，具有很高臨床使用價(jià)值。

雖然HBV-DNA 和/或HBsAg 是評(píng)價(jià)病毒復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)，也是乙型肝炎患者安全停藥的重要指標(biāo)［7］。在抗病毒治療過程中，由于核苷（酸）類藥物［nucleot（s）ide analogues，NUCs］不能清除共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）［8］，因此很難實(shí)現(xiàn)慢性乙肝的臨床治愈，而且患者停藥后往往發(fā)生病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系魯鳳民團(tuán)隊(duì)成功研制出國(guó)內(nèi)首個(gè)血清HBV RNA 熒光定量（TaqMan 探針法）檢測(cè)試 劑［9］，將cccDNA 產(chǎn)生的基 因 組RNA 前體（pgRNA）作為新的檢測(cè)靶點(diǎn)，用于評(píng)估肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA 的存在和轉(zhuǎn)錄活性，作為抗病毒治療療效判定及停藥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)判的新指標(biāo)。

未來，以HBV DNA 和HBV RNA 聯(lián)合檢測(cè)的方法，將可能成為臨床乙型肝炎診斷和治療的新模式，為我國(guó)消滅乙型肝炎病毒及提升我國(guó)乙型肝炎的診斷水平做出重大貢獻(xiàn)。