大孔吸附樹脂分離核桃青皮萘醌類成分及其抑菌性研究

劉迪，宋曉宇，李婧，尚華，楊建民

1.陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712000 2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司，陜西 西安 710100

核桃青皮(walnut green husk)又稱青龍衣，在我國古代就因其具有鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎、抗腫瘤等多種功效而被入藥[1-9]。核桃的果實(shí)可食用或被加工成各種核桃產(chǎn)品，食用或加工后的核桃會(huì)產(chǎn)生大量的核桃青皮廢物，甚至還會(huì)污染環(huán)境。

為了對(duì)核桃青皮再次利用，本研究以核桃青皮中代表性有效成分萘醌為分離對(duì)象，采用大孔分離樹脂分離響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分離參數(shù)，同時(shí)考察核桃青皮萘醌提取物的抑菌性，為核桃青皮變廢為寶提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮粉，購于陜西省寶雞市，50 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，經(jīng)0.15 mm孔徑的篩孔過濾，裝袋封口，0～4 ℃冰箱保存；1,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品(含量>98%)，Sigma-Aldrich公司；乙醇、甲醇、醋酸鎂、二氯甲烷三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋅、雙氧水、亞硫酸鈉，均為分析純；D101樹脂，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉浸膏、氯化鈉、蒸餾水、磷酸鹽，均為國產(chǎn)生化試劑或化學(xué)試劑；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，由陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物試驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5300PC型紫外/可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司； RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；BT100-1L恒流泵：蘭格恒流泵有限公司；AL204型電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；無菌工作臺(tái)：上海瑞宏檢測技術(shù)有限公司；培養(yǎng)箱，上海立德泰勀科學(xué)儀器有限公司；電熱手提高壓蒸汽消毒鍋，成都志能實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[10]

將1,8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品在105 ℃烘箱內(nèi)干燥，準(zhǔn)確稱取0.002 g標(biāo)準(zhǔn)品，用少量60%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，用60%乙醇定容至10 mL，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至25 mL比色管中，準(zhǔn)確加入1 mL濃度為5%KOH溶液，再用60%乙醇溶液定容至25 mL；準(zhǔn)確移取1 mL濃度為5%KOH溶液，用60%乙醇溶液定容至25 mL，作為空白對(duì)照。在530 nm下，測定不同濃度溶液的吸光度值，利用線性擬合，得到吸光度(y)與標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程。

1.3.2 粗提液的制備

稱取一定量核桃青皮粉，按照1∶40(g∶mL)的料液比與60%乙醇混合，放入60 ℃水浴鍋中浸提6 h，取出抽濾兩次，將濾液合并在50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，制備不同濃度的粗提液，作為樹脂上柱液使用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

考察吸附液濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25%)、吸附液pH值(1、2、3、4、5)和吸附液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min)對(duì)核桃青皮萘醌類成分的提取率影響；考察洗脫液濃度(10、85、90、95、100%)、洗脫液pH值(1、2、3、4、5)和洗脫液流速(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL/min)對(duì)核桃青皮萘醌類成分的洗脫率影響。選用3因素3水平，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.4 萘醌提取物抑菌試驗(yàn)

1.3.4.1 供試液的制備

將核桃青皮粗提液和樹脂分離提取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏，分別稱取0.5 g，用20 mL50%的無菌水丙酮溶液進(jìn)行溶解，得到濃度為25 mg/mL的原始供試液，將原始供試液依次進(jìn)行兩次梯度稀釋，并標(biāo)記為1#、2#和3#供試液，其濃度分別為25 mg/mL，12.5 mg/mL和6.25 mg/mL。將無菌水丙酮溶液編為0#，作為空白液。

1.3.4.2 抑菌試驗(yàn)

分別吸取大腸桿菌供試菌液和金黃色葡萄球菌供試菌液(細(xì)菌濃度>107個(gè)/mL)0.1 mL于冷凝好的兩個(gè)培養(yǎng)基上，用無菌刮鏟涂布，平放于無菌臺(tái)上20～30 min。在培養(yǎng)基平板后面，用記號(hào)筆劃“+”，將皿底等分成四等分。在涂有大腸桿菌的培養(yǎng)基后面將各區(qū)標(biāo)記D0#、D1#、D2#和D3#，在涂有金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基后面將各區(qū)標(biāo)記P0#、P1#、P2#和P3#。剪取直徑為5 mm的圓形濾紙片，分別浸入0#、1#、2#和3#供試液中，將各濾紙片按照編號(hào)分別放入各培養(yǎng)皿的4個(gè)區(qū)內(nèi)，濾紙片應(yīng)按照濃度由低到高的順序放置。每個(gè)平板做3個(gè)平行。將培養(yǎng)基倒置，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈的大小。抑菌圈大小按照下式計(jì)算：

抑菌圈直徑=樣品菌落直徑-空白菌落直徑。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)和體外抗氧化性試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示；響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0軟件處理和分析；數(shù)據(jù)顯著性分析用t-檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，P<0.05被視為顯著性差異，P<0.01被視為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.3.1方法，得到萘醌標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=124.38x-1.019，回歸系數(shù)R2= 0.992 4，能夠滿足檢測需要。

圖1 萘醌標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 核桃青皮萘醌提取工藝優(yōu)化

2.2.1 樹脂吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果

樹脂吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示最優(yōu)吸附條件為吸附液濃度0.10 mg/mL、吸附pH值2、吸附液流速0.5 mL/min。其中，吸附液濃度和吸附液pH值對(duì)吸附率影響，均隨著單因素?cái)?shù)值的增大而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；吸附液流速大，吸附率反而下降。吸附液濃度過小，樹脂吸附不飽和，吸附率不高；濃度過大，樹脂過飽和，吸附率幾乎不再變化。吸附液pH值大小影響樹脂吸附效果，過小或過大，均使吸附效果不能達(dá)到最大化。吸附液流速變大，樹脂來不及及時(shí)吸附，從而使吸附率降低。

吸附液濃度 / (mg·mL-1)(a)吸附液濃度對(duì)吸附率的影響

吸附液pH值(b)吸附液pH值對(duì)吸附率的影響

吸附液流速/ (mL·min-1)(c)吸附液流速對(duì)吸附率的影響圖2 各因素對(duì)吸附率影響

2.2.2 樹脂吸附響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果如表2、3所示。

表1 樹脂吸附響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 樹脂吸附響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 樹脂吸附響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

注：*表示顯著水平(P<0.05)；**表示極顯著水平(P<0.01)

各因素的P值大小表明其對(duì)結(jié)果影響的顯著性，P值數(shù)據(jù)顯示，吸附液濃度的影響極顯著(P<0.01)，吸附液pH的影響顯著(P<0.05)，吸附液濃度二次方的影響極顯著(P<0.01)，吸附液pH二次方的影響顯著(P<0.05)，各因素之間吸附液濃度和吸附液pH之間的交互作用P值最小。F值顯示各因素對(duì)結(jié)果影響順序?yàn)椋何揭簼舛?吸附液pH>吸附流速。

回歸分析給出模型的二次回歸方程為:

R=-7.95+1 301.6A+18.705B-9.84C+7.00AB+4.00AC-0.60BC-5 748.00A2-4.47B2+5.12C2

此方程對(duì)應(yīng)的最佳提取條件：吸附液濃度0.11 mg/mL，吸附液pH為1.89，吸附流速0.54 mL/min，預(yù)測最大吸附率為82.11%。對(duì)最佳條件取整為：吸附液濃度0.10 mg/mL，吸附液pH為2，吸附流速0.5 mL/min，確定該條件為最佳實(shí)際操作條件，以便于工業(yè)化生產(chǎn)。在確定的最佳實(shí)際操作條件下平行試驗(yàn)3次，測得到平均吸附率為81.89%。

2.2.3 樹脂洗脫單因素試驗(yàn)結(jié)果

樹脂洗脫單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示最優(yōu)洗脫條件為洗脫液濃度96%、洗脫pH值3、洗脫液流速0.5 mL/min。各因素對(duì)洗脫率影響，均隨著單因素?cái)?shù)值增大而呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。洗脫液濃度和pH 值大小直接影響洗脫液的極性，從而影響洗脫效果。洗脫液流速過小，洗脫液總量小，洗脫效果不佳；洗脫液流速過大，被吸附成分來不及完全被洗脫液帶走，洗脫率降低。

洗脫液濃度/%(a)洗脫液濃度對(duì)洗脫率的影響

洗脫液pH值(b)洗脫液pH值對(duì)洗脫率的影響

洗脫流速/(mL·min-1)(c)洗脫液流速對(duì)洗脫率的影響圖3 各因素對(duì)洗脫率影響

2.2.4 樹脂洗脫試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表4所示，試驗(yàn)結(jié)果如表5、6所示。

表4 樹脂洗脫響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表5 樹脂洗脫響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表6 樹脂洗脫響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

注：*表示顯著水平(P<0.05)；**表示極顯著水平(P<0.01)。

各因素的P值大小表明其對(duì)結(jié)果影響的顯著性，P值數(shù)據(jù)顯示，洗脫液濃度的影響極顯著(P<0.01)，洗脫流速的影響顯著(P<0.05)，洗脫液濃度二次方的影響極顯著(P<0.01)，洗脫流速二次方的影響顯著(P<0.05)，各因素之間洗脫液濃度和洗脫液pH之間的交互作用P值最小。F值顯示，各因素對(duì)結(jié)果影響順序?yàn)椋合疵撘簼舛? 洗脫流速>吸附液pH。

回歸分析給出模型的二次回歸方程為：

R=5 528.953 12+117.574 50A+17.147 50B+83.812 50C-0.135 00AB-0.275 00AC+0.625BC-0.619 30A2-0.682 50B2-67.062 50C2

此方程對(duì)應(yīng)的最佳提取條件洗脫液濃度94.45%，洗脫液pH為3.43，洗脫流速0.45 mL/min，預(yù)測最大洗脫率為71.77%。對(duì)最佳條件取整為：洗脫液濃度95%，洗脫液pH為3.5，洗脫流速0.5 mL/min，確定該條件為最佳實(shí)際操作條件，以便于工業(yè)化生產(chǎn)。在確定的最佳實(shí)際操作條件下平行試驗(yàn)3次，并測得到平均洗脫率為70.63%。

2.3 萘醌提取物抗菌性試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度提取物抑菌圈的大小如表7所示，同一濃度的提取物對(duì)不同菌種的抑菌能力大小如圖4和圖5所示。不同提取物在濃度為50 mg/mL和25 mg/mL對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出了一定的抑菌能力，而濃度低于25 mg/mL則不可檢出抑菌圈，且同一濃度下，樹脂分離提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均高于粗提物。

表7 提取物抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 提取物對(duì)大腸桿菌抑菌效果

圖5 提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，核桃青皮萘醌類成分樹脂吸附最優(yōu)條件為：吸附液濃度0.1 mg/mL、吸附液pH值2、吸附流速0.5 mL/min，在此條件下吸附率可達(dá)81.89%，各因素對(duì)吸附率影響順序?yàn)椋何揭簼舛?吸附液pH>吸附流速；最優(yōu)洗脫條件為：丙酮洗脫液濃度95%、洗脫液pH值3.5、洗脫流速0.5 mL/min，在此條件下洗脫率可達(dá)70.63%。各因素對(duì)洗脫率影響順序?yàn)椋合疵撘簼舛? 洗脫流速>洗脫液pH；抑菌試驗(yàn)表明，提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑制作用，且萘醌樹脂分離提取物的抑菌性高于粗提物。