亞硒酸鈉對(duì)湯姆青霉菌核分化和抗氧化性的影響

李改平，韓建榮，杜引弟

（1.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西晉中030619；2.山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西太原030006；3.山西省中醫(yī)學(xué)校，山西晉中030619）

抗氧化協(xié)同效應(yīng)是指2 種或2 種以上的抗氧化物聯(lián)合使用，獲得高于單獨(dú)使用其中任何一種抗氧化物抗氧化性的效果。其包括：抗氧化物與抗氧化物之間的協(xié)同效應(yīng)、抗氧化物與維生素之間的協(xié)同效應(yīng)、抗氧化物與有機(jī)酸及其衍生物之間的協(xié)同效應(yīng)和抗氧化物與微量元素之間的協(xié)同效應(yīng)[1]。在機(jī)體內(nèi)，硒是一種必需的微量元素，本身具有一定抗氧化性，會(huì)與VE等抗氧化物產(chǎn)生抗氧化協(xié)同效應(yīng)[2]。PT95 和Q1 菌株菌核內(nèi)可積累類胡蘿卜素和抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)，并具有一定的抗氧化性。

本試驗(yàn)將在MEA 培養(yǎng)基中添加不同濃度的亞硒酸鈉（Na2SeO3），觀察硒對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核分化的影響，并通過(guò)測(cè)定菌核中的類胡蘿卜素含量、抗壞血酸含量、總酚含量及其提取物的還原力、DPPH 自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力和清除超氧陰離子的能力來(lái)評(píng)價(jià)硒對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核抗氧化性的影響；同時(shí)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核的富硒培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 供試菌株為Penicillium thomii PT95菌株和Penicillium thomii Q1 菌株，由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，查氏（CA）斜面保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥芽汁培養(yǎng)基（MEA）：麥芽膏20 g，蛋白胨1.0 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：20%馬鈴薯煮汁1 000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

1.2 試驗(yàn)方法

在PDA 和MEA 培養(yǎng)基中添加Na2SeO3，使得培養(yǎng)基中Na2SeO3的濃度分別達(dá)到3，6，10 μg/mL，這些培養(yǎng)基作為不同的富硒生長(zhǎng)條件，同時(shí)以沒(méi)有添加Na2SeO3的培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)9 cm 培養(yǎng)皿倒入25 mL 培養(yǎng)基，凝固后用接種針挑取3 粒單菌核，用三點(diǎn)接種法接入培養(yǎng)皿中，置于黑暗條件下，25 ℃培養(yǎng)25 d。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察菌株的滲出液滲出時(shí)間、菌核出現(xiàn)時(shí)間以及菌核成熟時(shí)間，并做好記錄。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 菌核生物量的測(cè)定 用蒸餾水將成熟的PT95 菌核和Q1 菌核從培養(yǎng)基表面沖洗下來(lái)，反復(fù)沖洗5～10 次，置于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取及含量測(cè)定 按韓建榮等[3]和付榮榮等[4]的方法提取菌核中的類胡蘿卜素，按王業(yè)勤等[5]的方法計(jì)算類胡蘿卜素含量。

1.3.3 硒含量測(cè)定[6]

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別取1.0～5.0 mL 的硒標(biāo)準(zhǔn)液（5 μg/mL）置于分液漏斗中，加入3 mL 鄰苯二胺溶液（0.1%），并用蒸餾水補(bǔ)至50 mL 左右，混合均勻后用甲酸（80%）和濃氨水將pH 值調(diào)至2.0，將該混合物在室溫下放于黑暗中靜置60 min，用10 mL 甲苯振蕩萃取該混合物3 min 后再靜置8 min，棄去水層，將剩余的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，并用甲苯定容，在335 nm 處比色。

1.3.3.2 菌核中硒含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取2 g 菌核，加入30 mL 混合酸（V（HNO3）：V（H2SO4）＝4∶1）后蓋上表面皿，并于黑暗中冷消化24 h。將冷消化后的溶液加熱消化至澄清，冷卻后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并用水定容。

式中，C 為來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)曲線的相當(dāng)于硒的標(biāo)準(zhǔn)濃度（μg/mL）；V 為從甲苯萃取得到的樣品體積（mL）；W 為樣品質(zhì)量（g）；N 為用于測(cè)定的樣品體積占總定容后樣品的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.4 抗氧化性測(cè)定

1.3.4.1 提取菌核抗氧化物質(zhì) 稱取干菌核1 g，加入20 mL 乙醇（80%），在50 ℃150 r/min 的搖床上提取24 h，采用濾紙過(guò)濾保留濾液。濾渣仍用20 mL乙醇（80%）重復(fù)提取，2 次濾液合并，使用80%的乙醇稀釋定容至100 mL 作為母液，濾渣烘干稱質(zhì)量。

1.3.4.2 總酚含量的測(cè)定 采用Folin-Cioncalteu比色法[8-9]測(cè)定樣品總酚含量。在0.4 mL 菌核提取物稀釋液或沒(méi)食子酸稀釋液中加入2.8 mL 蒸餾水和0.2 mL Folin-Cioncalteu 試劑，混合均勻后靜置6～8 min，再加入0.6 mL 飽和Na2SeO3溶液，室溫下黑暗靜置120 min，在760 nm 處測(cè)定其OD 值。標(biāo)準(zhǔn)曲線則使用0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 的沒(méi)食子酸稀釋液進(jìn)行繪制。

1.3.4.3 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定采用文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。將200 μL樣品液加入濃度為0.08 mmol/L 的DPPH（3.8 mL）中，充分搖勻后在室溫下避光靜置24 h，之后在517 nm處測(cè)定吸光度值。用提取溶劑代替樣品液作為對(duì)照。EC50值是根據(jù)吸光度和樣品液濃度來(lái)計(jì)算。

1.3.4.4 測(cè)定還原能力 用鐵氰化鉀還原法測(cè)定[11]，EC50值是依據(jù)吸光度和樣品液濃度計(jì)算。

1.3.4.5 亞鐵離子螯合能力測(cè)定 其采用文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定。將1.6 mL 樣品溶液溶于1.6 mL 蒸餾水中，然后與0.4 mL 濃度為0.5 mmol/L 的FeCl2溶液混合搖勻，然后再加入0.4 mL 濃度為1 mmol/L的菲洛嗪。劇烈搖動(dòng)1 min，室溫下放置20 min，在562 nm 處測(cè)定吸光度值。以80%乙醇代替樣品作為空白，0.5 mmol/L EDTA 作為陽(yáng)性對(duì)照。EC50值是根據(jù)吸光度和樣品液濃度來(lái)計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多個(gè)均數(shù)間的兩兩比較采用Duncan 多重比較法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核分化的影響

在PDA 和MEA 培養(yǎng)基中添加不同濃度的Na2SeO3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDA 培養(yǎng)基表面幾乎沒(méi)有菌核形成，而MEA 培養(yǎng)基添加硒后比較有利于2 株菌核的分化。從表1 可以看出，在MEA 培養(yǎng)基中添加Na2SeO3，隨著Na2SeO3濃度的提高，2 株菌株滲出液出現(xiàn)的時(shí)間都延后了1～2 d，菌核出現(xiàn)的時(shí)間延后了3～5 d，菌核成熟的時(shí)間延后了4～6 d，且Q1 菌株菌核的分化比PT95 菌株菌核的分化普遍要快。

表1 Na2SeO3 對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核分化的影響 d

2.2 亞硒酸鈉對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核生物量的影響

從表2 可以看出，在添加Na2SeO3的培養(yǎng)基上，2 株菌株的菌核生物量與硒濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（rPT95＝－0.901，rQ1＝－0.939）；當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SeO3的濃度為10 μg/mL 時(shí)，2 株菌株的菌核生物量最小，分別為0.20，0.09 mg/ 平板，是對(duì)照的0.80 倍和0.39 倍。

表2 Na2SeO3 對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核生物量的影響 mg/平板

2.3 亞硒酸鈉對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核類胡蘿卜素含量的影響

由圖1 可知，在添加Na2SeO3的MEA 培養(yǎng)基上，PT95 菌株菌核中的類胡蘿卜素含量與外源Na2SeO3濃度呈一定的正相關(guān)（r＝0.526），當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SeO3的質(zhì)量濃度為3 μg/mL 時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到了最大（85.00 μg/g），是對(duì)照的10.76 倍；Q1 菌株菌核中的類胡蘿卜素含量與外源Na2SeO3濃度呈一定的正相關(guān)（r＝0.752），當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SeO3的質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到了最大（62.90 μg/g），是對(duì)照的5.57 倍。

2.4 亞硒酸鈉對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核總酚含量的影響

從圖2 可以看出，湯姆青霉PT95 菌株菌核提取物中總酚含量與外源Na2SeO3濃度之間有一定的負(fù)相關(guān)性（r＝-0.367）；Q1 菌株菌核提取物中總酚含量與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的負(fù)相關(guān)性（r＝-0.908），對(duì)照的總酚含量最高，分別達(dá)到了15.59，15.15 mg/g，不同培養(yǎng)條件下菌核總酚含量的大小為MEA＋Na2SeO310 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL。

2.5 亞硒酸鈉對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核抗氧化性的影響

表3 顯示，MEA 培養(yǎng)基上，PT95 和Q1 菌株菌核提取物還原能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有一定的負(fù)相關(guān)性（rPT95＝-0.757，rQ1＝-0.793），添加不同濃度的外源Na2SeO3后，2 個(gè)菌株菌核提取物還原能力的EC50值顯著低于對(duì)照。

表3 Na2SeO3 對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核還原力的影響

綜上所述，當(dāng)MEA 培養(yǎng)基中含有一定濃度的外源Na2SeO3（10 μg/mL）時(shí)，有利于2 株菌株菌核提取物還原力的提高。

從表4 可以看出，MEA 培養(yǎng)基上，湯姆青霉PT95 菌株菌核提取物DPPH 自由基清除能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有弱的正相關(guān)性（r＝0.239）；對(duì)照的DPPH 自由基清除能力最大（0.38 mg/mL），不同培養(yǎng)條件下，DPPH 自由基清除能力的大小為MEA＋Na2SeO310 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL。Q1 菌株菌核提取物DPPH 自由基清除能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有弱的負(fù)相關(guān)性（r＝-0.230）；不同培養(yǎng)條件下，DPPH 自由基清除能力的大小為MEA＋NaNa2SeO310 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL。

表4 Na2SeO3 對(duì)PT95 菌株和Q1 菌株DPPH自由基清除能力的影響

表4 結(jié)果表明，添加外源Na2SeO3不利于PT95菌株DPPH 自由基清除能力的提高，添加較高濃度的Na2SeO3（10 μg/mL）有利于Q1 菌株DPPH 自由基清除能力的提高，但提高的幅度不大。

從表5 可以看出，在MEA 培養(yǎng)基上，PT95 菌株菌核提取物亞鐵離子螯合能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的正相關(guān)性（r＝0.936）；對(duì)照的亞鐵離子螯合能力最大（0.53 mg/mL），不同培養(yǎng)條件下，亞鐵離子螯合能力的大小為MEA＋Na2SeO36 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO310 μg/mL。Q1 菌株菌核提取物亞鐵離子螯合能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的正相關(guān)性（r＝0.954），對(duì)照的亞鐵離子螯合能力最大（0.41 mg/mL）；不同培養(yǎng)條件下，亞鐵離子螯合能力的大小為MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL＞MEA＋Na2SeO310 μg/mL。

表5 Na2SeO3 對(duì)PT95 和Q1 菌株亞鐵離子螯合能力的影響

結(jié)果表明，添加外源Na2SeO3不利于2 株菌株亞鐵離子螯合能力的提高。

2.6 亞硒酸鈉對(duì)PT95 和Q1 菌株菌核硒含量的影響

從圖3 可以看出，在MEA 培養(yǎng)基上，PT95 菌株菌核的硒含量與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的正相關(guān)性（r＝0.940），并在Na2SeO3的質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)達(dá)到最大（6.09 μg/g）；Q1 菌株菌核的硒含量與外源Na2SeO3濃度之間有弱的正相關(guān)性（r＝0.128），并在Na2SeO3濃度為3 μg/mL 時(shí)達(dá)到最大（5.23 μg/g）。

3 討論

亞硒酸鈉是最常用的富硒劑[14]，多用于對(duì)動(dòng)物[15]和植物[16]的研究，將其用于真菌則多作用于酵母[17]和大型的食用真菌[18]，但是亞硒酸鈉有毒，使用受到一定的限制。亞硒酸鈉對(duì)于產(chǎn)菌核（主要是微菌核）真菌的富硒培養(yǎng)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在MEA 培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒，類胡蘿卜素、酚類化合物和硒均可以在PT95菌株和Q1 菌株的菌核內(nèi)積累，且可以使2 株菌株菌核的類胡蘿卜素和硒含量得到不同程度的提高，但卻不能使總酚的含量提高。此外，當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SeO3的濃度為10 μg/mL 時(shí)，有利于2 株菌核提取物還原力的提高；除Na2SeO3的濃度為10 μg/mL時(shí)有利于Q1 菌株菌核提取物DPPH 自由基清除能力的提高外，其余條件下生長(zhǎng)的2 株菌株菌核提取物的DPPH 自由基清除能力均不能提高。添加不同濃度的硒均不利于2 株菌核提取物亞鐵離子螯合能力的提高。因此認(rèn)為，添加硒可能會(huì)改變抗氧化系統(tǒng)中各種抗氧化物質(zhì)之間的比例，從而使各指標(biāo)之間出現(xiàn)差異。