雞堆型艾美耳球蟲早熟株免疫效力分析及安全性評(píng)價(jià)

康慧鑫，王 麗，鄭明學(xué)，白 瑞，張 黎，張雪松，李瑞琪，郝思源，白 冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

雞球蟲病是專性寄生于家禽腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的一種寄生蟲病，誘發(fā)雞只腸炎并伴有腹瀉，因其多發(fā)、危害嚴(yán)重、防治困難，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。在已知的9 種雞球蟲中，堆型艾美耳球蟲流行率最高，分布廣泛，致病性較強(qiáng)，養(yǎng)殖中以混合感染常見[4-5]。

目前雞球蟲病仍以藥物防治為主，但蟲株的耐藥性以及因藥殘而引起的食品安全問題[6-9]日趨嚴(yán)重。在治療傳染病時(shí)，最有效的方法之一就是接種疫苗以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫[10]，疫苗免疫具有無殘留、效果確實(shí)、一次免疫終生保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)[11]。目前，商用的雞球蟲病疫苗有強(qiáng)毒活疫苗和弱毒活疫苗，由球蟲親本株制備的強(qiáng)毒活疫苗雖免疫效果良好，但因其致病力強(qiáng)、安全性差，易引起球蟲病暴發(fā)；而由球蟲親本株選育出的早熟弱毒球蟲疫苗因其安全性高、免疫效果好，得到廣泛推廣應(yīng)用[12-14]，故早熟選育弱毒株仍是雞球蟲病疫苗的主要研究方向。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室已獲得免疫原性良好、遺傳穩(wěn)定[15]的雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）早熟株，其二次免疫的最小免疫劑量為首免1 羽份（400 個(gè)/羽），二免2 羽份（800 個(gè)/羽）[16]。作為弱毒疫苗蟲株之一，Eimeria acervulina 早熟株的最小首免日齡、二次免疫間隔時(shí)間及安全性如何還有待研究。

本試驗(yàn)對(duì)Eimeria acervulina 早熟株進(jìn)行效力試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室安全性試驗(yàn)等基礎(chǔ)性研究，為雞球蟲早熟株疫苗研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 蟲株

雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）早熟株（Eap20，PAsx）和強(qiáng)毒株（Ea02，Asx）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

供試雞為1 日齡SPF 雛雞，由北京梅里亞維通試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供SPF 種雞蛋孵化而來。

1.3 Eimeria acervulina 早熟株免疫效力試驗(yàn)

1.3.1 最小首免日齡篩選試驗(yàn) 將體質(zhì)量相近的120 只1 日齡SPF 雛雞隨機(jī)分為12 組，每組10 只雞，分別為Eimeria acervulina 早熟株（PAsx）免疫攻毒組T1～T4、攻毒對(duì)照組C1～C4 和空白組C01～C04。T1～T4 組分別以1 羽份[16]于第1，2，4，6 日齡首免，首免后10 d 以2 羽份二免。二免后14 d 空腹稱質(zhì)量，對(duì)T1～T4 和C1～C4 組經(jīng)口接種20 萬個(gè)卵囊/羽強(qiáng)毒株（Asx）。攻毒第8 天各組雞只稱質(zhì)量、剖檢，進(jìn)行十二指腸病變記分、卵囊排出量測(cè)定，計(jì)算相對(duì)增質(zhì)量率、病變記分減少率（RLS）、卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)（ACI），來篩選其作為疫苗蟲株使用的最小首免日齡。

1.3.2 免疫間隔期篩選試驗(yàn) 將150 只體質(zhì)量相近的1 日齡SPF 雛雞隨機(jī)分為15 組，每組10 只雞，分別為免疫攻毒組TA1～TA5、攻毒對(duì)照組TB1～TB5 和空白組CA1～CA5。于4 日齡用400 個(gè)孢子化卵囊/ 羽PAsx 對(duì)TA1 ～TA5 組首免，間隔3，5，7，9，11 d 進(jìn)行二免。二免后第14 天稱質(zhì)量，對(duì)TA1～TA5 和TB1～TB5 組經(jīng)口接種20 萬個(gè)卵囊/羽Eimeria acervulina 強(qiáng)毒株，攻毒后觀察和測(cè)定指標(biāo)同1.3.1，確定疫苗蟲株2 次免疫的免疫間隔期。

1.4 Eimeria acervulina 早熟株實(shí)驗(yàn)室安全性試驗(yàn)

1.4.1 一次單劑量接種 將體質(zhì)量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機(jī)分為2 組，每組10 只雞，接種組TC1組接種PAsx 疫苗蟲株推薦免疫劑量的1 羽份/只疫苗蟲株，CC1 組為空白對(duì)照組。觀察各試驗(yàn)組雞臨床癥狀及死亡雞數(shù)，于接種后第14 d 稱質(zhì)量、剖檢，觀察各器官病理變化，進(jìn)行十二指腸平均病變記分，計(jì)算相對(duì)增質(zhì)量率。取各組雞的肝、腎、心、十二指腸、小腸中段制作組織切片，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.4.2 單劑量重復(fù)接種 將體質(zhì)量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機(jī)分為2 組，每組10 只雞，接種組TD2組接種PAsx 疫苗蟲株，CD2 組為不接種空白對(duì)照組。接種組于14，28 日齡分別以疫苗蟲株推薦免疫劑量1 羽份/只、2 羽份/只接種，隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)期和觀察指標(biāo)同1.4.1。

1.4.3 一次超劑量接種 將體質(zhì)量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機(jī)分為6 組，每組10 只雞，接種組TE3、TE4、TE5、TE6（接種蟲株同TC5 組）組分別接種20倍（16 000 個(gè)卵囊/只）二次免疫推薦使用劑量的三批PAsx 疫苗蟲株，CE3、CE4 組為不接種空白對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)。TE3、TE4、TE5 組和CE3 組試驗(yàn)期和觀察指標(biāo)同1.4.1。TE6 組和CE4 組于接種后第7 天稱質(zhì)量、剖檢，進(jìn)行平均病變記分并計(jì)算相對(duì)增質(zhì)量率。

1.5 判定指標(biāo)

相對(duì)增質(zhì)量率＝感染組雞平均增質(zhì)量/健康對(duì)照組雞平均增質(zhì)量×100% （1）

死亡率=組內(nèi)死亡雞數(shù)/組內(nèi)總雞數(shù)×100% （2）

OPG 是指1 g 糞便中含有的卵囊數(shù)目；腸道病變記分、十二指腸的病變記分參照J(rèn)OHNSON 等[17]、蔡秀敏[4]的方法。

RLS＝（不免疫攻毒組的平均病變記分－免疫攻毒組的平均病變記分）/不免疫攻毒組的平均病變記分×100% （3）

卵囊減少率＝（不免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量－免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量）/不免疫攻毒組卵囊平均產(chǎn)量×100% （4）

ACI＝（存活率＋相對(duì)增質(zhì)量率）×100－（病變值＋卵囊值）[17]（5）

免疫效果判定標(biāo)準(zhǔn)：綜合分析各項(xiàng)指標(biāo)，將死亡率為0、相對(duì)增質(zhì)量率≥80%、十二指腸病變記分≤1、RLS≥70%、卵囊減少率≥75%和ACI≥180判定為免疫效果良好。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，并用Prism 6.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eimeria acervulina 早熟株效力試驗(yàn)研究

2.1.1 最小首免日齡篩選試驗(yàn) 各免疫攻毒組雞群的精神狀態(tài)良好，未見死亡，TI～T4 組的相對(duì)增質(zhì)量率、卵囊減少率、病變記分減少率、抗球蟲指數(shù)均逐漸增高，與首免日齡呈正相關(guān)。T3、T4 組相對(duì)增質(zhì)量率均≥97.7%，平均病變記分≤0.8，RLS≥77.1%，卵囊減少率均≥95.0%，抗球蟲指數(shù)均≥189.7，達(dá)到良好免疫效果（圖1）。

2.1.2 不同免疫間隔期對(duì)免疫效力的影響Eimeria acervulina 早熟株以最小免疫劑量接種雛雞，2 次免疫間隔在3～11 d，隨著二次免疫間隔時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫攻毒組雞的相對(duì)增質(zhì)量率、卵囊減少率、病變記分減少率、抗球蟲指數(shù)升高。TA1～TA5 組病變記分均＜1，且差異不顯著（P＞0.05），RLS 均≥85.3，ACI 均≥182.4，卵囊減少率均≥90%，但免疫攻毒TA1、TA2 組平均增質(zhì)量極顯著低于TA3、TA4、TA5 組（P＜0.01）（圖2）。

2.2 Eimeria acervulina 早熟株安全性試驗(yàn)

2.2.1 一次單劑量接種 試驗(yàn)雞群精神狀態(tài)良好，死亡率為0。第14 天剖檢，各腸道未見眼觀病變，病變記分為0.0，接種組雞只的相對(duì)增質(zhì)量率大于80%（圖3）。

鏡檢發(fā)現(xiàn)，接種雞十二指腸絨毛上皮細(xì)胞少量脫落，十二指腸和空腸均可見發(fā)育不同階段的蟲體，其余組織均未見異常。

2.2.2 單劑量重復(fù)接種 試驗(yàn)雞群精神狀態(tài)良好，死亡率為0。重復(fù)接種14 d 后剖檢雞只，各腸道均無眼觀病變，病變記分為0.0，對(duì)照組也未見眼觀病變（圖3）。

鏡檢發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)雞十二指腸腸腔結(jié)構(gòu)較完整，絨毛上皮細(xì)胞少量脫落；十二指腸和空腸均可見發(fā)育不同階段的蟲體，其余組織均未見異常。

2.2.3 一次超劑量接種 三批疫苗蟲株16 000 個(gè)卵囊/只劑量接種組，雞只精神狀態(tài)未見異常，死亡率為0；第7 天剖檢發(fā)現(xiàn)，個(gè)別雞十二指腸黏膜有少量散在白色結(jié)節(jié)，平均病變記分為1.0，其他腸道未見明顯眼觀病變；14 d 后剖檢發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組與對(duì)照組雞只各腸段均無明顯眼觀病變，平均病變記分為0（圖3）。

鏡檢發(fā)現(xiàn)，第7 天剖檢雞只十二指腸大量腸絨毛從基底部斷裂，絨毛上皮細(xì)胞大量脫落；接種后14 d 雞只十二指腸部分絨毛斷裂，絨毛上皮細(xì)胞大量脫落；第7 天與第14 天剖檢雞十二指腸和空腸均可見發(fā)育不同階段的蟲體，其余組織均未見異常。

3 討論

弱毒活疫苗是依據(jù)活卵囊脫囊后在腸道內(nèi)周期性繁殖來獲得免疫保護(hù)，因此，免疫日齡的選擇也是其免疫是否成功的關(guān)鍵一步。首免日齡不宜過小或過大，球蟲脫囊需借助足夠的膽汁和胰凝乳蛋白酶以及肌胃的機(jī)械碾磨，接種日齡過小時(shí)，其肌胃、腸道機(jī)能不完善，致使其無法進(jìn)行內(nèi)生性發(fā)育以刺激雞體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；接種日齡過大，可能造成在免疫保護(hù)力產(chǎn)生前就已感染外界野毒。

張龍現(xiàn)等[18]研究發(fā)現(xiàn)，EimerCox plus 雞球蟲活苗最適免疫日齡為5 日齡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨首免日齡增大，各試驗(yàn)組的相對(duì)增質(zhì)量率、卵囊減少率、RLS、ACI 逐漸增高，4～6 日齡首免均可取得良好的免疫效果，以4 日齡為最小首免日齡。

球蟲病康復(fù)雞對(duì)再感染有抵抗力[19]，但若缺乏再感染，隨時(shí)間延長(zhǎng)，雞對(duì)球蟲的免疫力會(huì)減弱；使用一定數(shù)量卵囊對(duì)雞進(jìn)行免疫時(shí)，小劑量反復(fù)接種的免疫效果優(yōu)于一次大劑量接種[20]，這是因?yàn)槊庖叽螖?shù)少，產(chǎn)生的免疫滴度低，不能很好的預(yù)防球蟲病發(fā)生，而二次免疫可使抗體水平迅速提高，且免疫產(chǎn)生的抑制期較短。本試驗(yàn)將免疫間隔選擇在3 d以上，結(jié)果表明，隨著免疫間隔時(shí)間的增加，免疫攻毒雞的相對(duì)增質(zhì)量率、病變記分減少率、抗球蟲指數(shù)均呈上升趨勢(shì)，可見在最適時(shí)間進(jìn)行二次免疫，對(duì)雛雞有促生長(zhǎng)作用，并可增強(qiáng)免疫力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然二免間隔3～11 d 均可達(dá)到良好的保護(hù)效果，但二免間隔3～5 d 的攻毒組雞的相對(duì)增質(zhì)量明顯低于間隔7 d 以上的二免組，故將二免間隔定為7 d。

一次單劑量、單劑量重復(fù)和一次超劑量接種試驗(yàn)結(jié)果表明，接種雞十二指腸絨毛斷裂數(shù)量與接種劑量呈正相關(guān)，但重復(fù)接種時(shí)，雞體已獲得一定免疫力，所以，損傷相對(duì)要?。灰淮纬瑒┝拷臃N組個(gè)別雞十二指腸損傷較嚴(yán)重，這是由于大量蟲體在腸道內(nèi)行裂殖生殖，腸黏膜原有結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，腸黏膜上皮細(xì)胞局灶性壞死、脫落，并進(jìn)行炎癥反應(yīng)來抗損傷。三次安全性試驗(yàn)中，雞只未見死亡，精神狀態(tài)良好，除20 倍劑量接種組個(gè)別雞只腸道損傷嚴(yán)重外，其余各組雞只腸絨毛完整，無血管破裂現(xiàn)象，雞群平均病變記分均≤1，相對(duì)增質(zhì)量率均在80%以上。說明本疫苗蟲株對(duì)健康雛雞均安全，符合安全性要求。