miR-124過表達對肺動脈高壓大鼠右心重構(gòu)的影響*

鄭常龍， 符永玫， 詹浩洪， 陳天天， 鄒 勇， 梁彩倩△

(中山大學附屬第三醫(yī)院 1急診科, 2輸血科, 廣東 廣州 510630)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種肺血管阻力進行性升高，持續(xù)發(fā)展可導致右心肥厚和右心衰竭甚至死亡的嚴重心血管疾病[1]。盡管近年來用于治療PAH的“靶向”藥物，如磷酸二酯酶抑制劑和內(nèi)皮素受體拮抗劑等，雖能改善部分PAH患者的癥狀，但其不能明顯改善PAH患者預后[2]。右心重構(gòu)和右心衰竭是PAH患者死亡的主要原因。因此，積極探索PAH患者并發(fā)右心重構(gòu)和右心衰竭的發(fā)病機制并早期進行干預，對PAH患者的預后至關(guān)重要。

多種微小RNA(microRNA，miRNA，miR)參與了PAH的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。有研究表明miR-124在肺動脈高壓患者的肺血管平滑肌細胞和慢性缺氧誘導的PAH小鼠肺組織中均顯著下調(diào)，而且miR-124對肺血管平滑肌細胞的增殖有顯著的抑制作用[5]，這提示miR-124在肺動脈高壓的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用。那么，過表達miR-124能否通過抑制肺血管平滑肌細胞的異常增殖而降低肺動脈壓力，進而緩解右心重構(gòu)和右心衰竭呢？國內(nèi)外未見相關(guān)文獻報道。因此，本研究擬采用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體介導miR-124過表達的方法，觀察其對野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導的肺動脈高壓大鼠右心重構(gòu)的作用，并初步探討其可能的作用機制，為肺動脈高壓右心重構(gòu)患者的治療提供參考資料和新的思路，為肺動脈高壓的基因治療提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和試劑

32只6周齡SPF級雄性SD大鼠(體質(zhì)量180～200 g)采購于中山大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于該中心SPF級動物房中。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度恒定(22±2)℃，濕度恒定(55±5)%，每天人工光照明暗各12 h，24 h自由飲水進食。本實驗得到中山大學實驗動物倫理委員會的批準(批準編號為：IACUC-DB-16-1113)。

載體pHBAAV-U6-ZsGreen購自上海漢恒生物有限公司；大腸桿菌菌株DH5α購自Invitrogen；野百合堿購自Sigma；SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen；p-Samd2、Samd2和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗體購自Abcam；多導生理記錄儀(MP150型)購自BIOPAC；實時定量PCR儀購自ABI。

2 實驗方法

2.1重組腺相關(guān)病毒的包裝和滴度測定 從miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)獲得miR-124-3前體序列(5′-TGAGGGCCCCTCTGCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCTATACAATTAAGGC-ACGCGGTGAATGCCAAGAGAGGCGCCTCC-3′)，參考Luo等[6]的方法，構(gòu)建質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后克隆至pHBAAV-U6-ZsGreen質(zhì)粒的HpaI及XhoI位點，產(chǎn)生AAV-miR-124重組體。重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染至293T細胞，大量包裝復制AAV-miR-124，以空白質(zhì)粒AAV-GFP作對照，經(jīng)純化后檢測滴度。AAV-miR-124 和 AAV-GFP的滴度分別為1.4×1015vg/L和2.0×1015vg/L (vg=viral genomes)。

2.2動物模型的建立與分組 所有大鼠經(jīng)隨機數(shù)字表法隨機分為4組：正常對照(control，n=8)組、野百合堿(MCT+NS，n=8)組、野百合堿+AAV-GFP(MCT+GFP，n=8)組和野百合堿+AAV-miR-124(MCT+miR-124，n=8)組，其中MCT+NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124組大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后固定于傾斜60°的大鼠操作臺，插入自制的氣管導管套管，使用微量注射器經(jīng)氣管導管分別緩慢注入100 μL生理鹽水、AAV-GFP和AAV-miR-124。3周后，MCT+NS組、MCT+GFP組和MCT+miR-124組大鼠一次性經(jīng)腹腔注射野百合堿(60 mg/kg)建立PAH右心重構(gòu)模型，飼養(yǎng)5周后達實驗終點。

2.3右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure, RVSP)和平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)的測定 根據(jù)鄒麗珍等[7]的方法測量大鼠RVSP和MAP。簡要步驟為：用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，固定后暴露頸外靜脈，結(jié)扎遠端，顯微剪在頸外靜脈近心端剪開約1/3，插入已預充盈肝素鈉鹽水(1×105U/L)的PE-100聚乙烯管，聚乙烯管通過換能器連接MP150多導生理記錄儀，記錄RVSP。穩(wěn)定10 min后保存數(shù)據(jù)，退出導管。分離出頸總動脈，插入PE-50聚乙烯管，固定待波形穩(wěn)定后記錄動脈波形，測定大鼠平均體循環(huán)動脈壓mSAP。

2.4右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)和右心室重量指數(shù)(right ventricular weight index, RVWI)的測定 脫臼法處死大鼠后分離出心臟，洗凈血液，于4 ℃ PBS中剪除心房，沿室間溝分離出右心室(RV)和左室加室間隔(LV+S)兩部分，用濾紙吸干表面的水分，分別稱重后計算二者的比值即為RVHI，即RVHI=RV/(LV+S)。計算右心室(RV)重量與大鼠體重(BW)的比值即為RVWI，即RVWI=RV/BW。

2.5大鼠右心天狼星紅染色 右心組織塊經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、包埋后切片，行天狼星紅染色。染色步驟為：石蠟切片經(jīng)60℃烤箱中烤片2 h后，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，入天青石藍液8～10 min，蒸餾水輕輕沖洗4～6 min，再入天狼星紅飽和苦味酸染液染20～30 min。直接用無水乙醇快速分化和脫水，經(jīng)二甲苯透明后用中性樹膠封片。使用倒置顯微鏡觀察右心組織心肌細胞的病理學改變，高倍鏡(×400)下隨機拍照并分析。

2.6RT-qPCR檢測肺和右心組織中miR-124的表達 取大鼠肺組織100 mg(或右心組織30 mg)，加入1 mL(或0.5 mL，右心組織) TRIzol中充分研磨裂解后加入氯仿提取總RNA，純化后用核酸蛋白測定儀測定A260/A280比值，比值在1.8～2.0之間用于實驗。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Green 法實時定量 PCR 檢測miR-124的表達水平。PCR 反應體積為25 μL： cDNA 1 μL，上、下游引物各10 pmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。miR-124的上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAAGGCACGCGGTGA-AT-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；內(nèi)參照U6的上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。擴增條件為：50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。PCR擴增完成后，所得結(jié)果由操作系統(tǒng)自動生成，目標基因的相對定量按2-ΔΔCt計算。

2.7Western blot檢測右心組織中TGF-β1和p-Smad2的表達 取約50 mg右心組織，剪碎后加入RIPA裂解液，充分研磨后經(jīng)離心提取上清備用。Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)用SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用含有5%脫脂奶粉的TBS-T溶液封閉4 h后，分別加入抗TGF-β1、p-Smad2、Smad2和β-actin抗體(1 ∶1 000)，于4℃孵育過夜。用TBS-T于室溫下洗膜4次(每次15 min)后加入Ⅱ抗，羊抗兔或小鼠IgG(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進行顯色。應用ImageJ圖像分析軟件進行比較分析。

3 統(tǒng)計學分析

所有計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計處理用SPSS 19.0軟件，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-124在各組大鼠肺和右心組織中的表達

與control組相比，MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠肺組織中miR-124的表達顯著減少(P<0.05)，而MCT+miR-124組miR-124的表達顯著增加(P<0.05)，見圖1A。4組大鼠右心組織中miR-124的表達無顯著差異(P>0.05)，見圖1B。

Figure 1. The expression of miR-124 in the lung (A) and right heart (B) tissues in each group. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

圖1 miR-124在各組大鼠肺和右心組織中的表達

2 各組大鼠RVSP和MAP的比較

到達實驗終點前(野百合堿注射5周內(nèi))，MCT+NS組和MCT+GFP組各有2只大鼠死亡，MCT+miR-124組死亡1只，control組無大鼠死亡，4組間死亡率無顯著差異(P>0.05)。MCT+NS組和MCT+GFP組的RVSP均顯著高于control組(P<0.05)，與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組的RVSP顯著降低(P<0.05)；4組動物的MAP無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠RVSP和MAP的比較

Table 1.Comparison of RVSP and MAP in each group (mmHg. Mean±SD)

GroupnRVSPMAPControl823.2±1.0128.0±7.0MCT+NS671.9±9.9*115.0±11.6MCT+GFP675.1±17.9*111.0±8.7MCT+miR-124749.3±7.7*#120.0±18.4

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

3 各組大鼠RVHI和RVWI的比較

野百合堿注射5周后，與control組相比，MCT+NS組和MCT+GFP組的RVHI和RVWI均顯著增高(P<0.05)；與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組的RVHI和RVWI均顯著降低(P<0.05)，見圖2。

4 各組大鼠右心室天狼星紅染色

天狼星紅染色結(jié)果顯示， control組大鼠右心室心肌細胞排列整齊，大小較均一，分布較均勻，膠原沉積較少；MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠心肌細胞肥大且排列紊亂，膠原沉積顯著增多； MCT+miR-124組心肌細胞排列稍紊亂，與MCT+GFP組相比，心肌細胞肥大減輕，膠原沉積顯著減少，見圖3。

5 大鼠右心組織中TGF-β1和 p-Smad2蛋白表達的比較

Western blot檢測結(jié)果提示，與control組相比， MCT+NS組和MCT+GFP組右心組織中TGF-β1和 p-Smad2的表達顯著上調(diào)(P<0.05)，而與MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組大鼠右心組織中TGF-β1和 p-Smad2的表達顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Comparison of RVHI (A) and RVWI (B) in each group. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

圖2 各組大鼠RVHI和RVWI的比較

討 論

肺動脈壓力進行性增高導致的右心重構(gòu)和右心衰竭是影響PAH患者預后的重要因素[8]。盡管近年來，超聲心動圖和磁共振成像在右心室解剖和病理評估上取得了很大的進展，但目前PAH右心室重構(gòu)的機制仍不明確，臨床上尚沒有直接或選擇性治療右心衰竭的有效方法。因此，尋找一種有效改善右心重構(gòu)和右心功能的方法有重要的臨床意義。

MCT誘導的大鼠PAH和右心重構(gòu)模型與臨床上右心重構(gòu)和右心衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程相似，具有經(jīng)濟、簡便和可復制性等特點，是目前常用的研究PAH和右心重構(gòu)的動物模型[9]。單劑腹腔或皮下注射MCT(60 mg/kg)可導致大鼠肺動脈血管平滑肌和血管外膜成纖維細胞的異常增殖和遷移，肺內(nèi)小動脈中膜肥厚，肺動脈壓力進行性增高，4～5周可出現(xiàn)右心室重構(gòu)和右心衰竭，甚至死亡[10]。本研究中，MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠從MCT注射后第3周開始出現(xiàn)體質(zhì)量增幅減少甚至下降，第4周開始出現(xiàn)活動量顯著減少、呼吸困難等右心衰竭癥狀。到達實驗終點時，MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠RVSP和RVHI均顯著高于control組，右心的心肌細胞肥厚程度、膠原纖維沉積顯著高于control組，表明大鼠右心重構(gòu)模型建立成功。

Figure 3.Over-expression of miR-124 attenuated right ventricular myocardial remodeling induced by monocrotaline (MCT) in rats (Sirius red staining). The scale bar=50 μm.

圖3 miR-124過表達減輕野百合堿誘導的大鼠右心室心肌重構(gòu)

Figure 4. The expression of TGF-β1and p-Smad2 in right heart tissues in each group detected by Western blotting. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

圖4 各組大鼠右心組織中TGF-β1和p-Smad2蛋白的表達

近年來，越來越多的研究表明miR-124在PAH的發(fā)病和進展中起著非常重要的作用。本研究的結(jié)果提示，miR-124在野百合堿誘導的PAH大鼠肺組織中的表達顯著下降，而AAV介導的miR-124過表達可顯著降低野百合堿誘導的RVSP和RVWI，減少右心室膠原沉積，減輕右心重構(gòu)。肺動脈血管平滑肌和血管外膜成纖維細胞的異常增殖和遷移是PAH的病理生理基礎。Kang等[5]的研究表明，miR-124在肺動脈高壓患者肺組織以及低氧誘導的PAH小鼠的肺血管平滑肌細胞中均顯著下調(diào)；miR-124可通過作用于PTBP1基因進而抑制肺血管平滑肌細胞的增殖。Wang等[11]研究證實，miR-124在肺動脈高壓患者及牛肺動脈外膜成纖維細胞中的表達顯著下調(diào)；過表達miR-124能顯著抑制成纖維細胞的增殖和移行。因此，我們推測過表達miR-124降低肺動脈高壓、減輕右心室重構(gòu)的機制可能與其抑制肺血管平滑肌細胞和成纖維細胞的異常增殖有關(guān)，但其具體機制需進一步研究。

TGF-β1是一種具有多功能生物學活性的細胞因子[12]。TGF-β1與其受體結(jié)合后，可激活其下游的信號分子Smad2/3，活化的Smad2/3和Smad4結(jié)合，入細胞核后可調(diào)控細胞的增殖和遷移、基質(zhì)的形成、損傷修復和間質(zhì)纖維化等活動[13]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1和 p-Smad2在正常大鼠的右心組織中低水平表達，在MCT+NS組和MCT+GFP組大鼠右心組織中的表達顯著上調(diào)，提示TGF-β1/Smad2信號通路的激活參與了右心重構(gòu)。Long等[14]的研究結(jié)果也表明，TGF-β1抑制劑可降低MCT誘導的PAH,減輕右心重構(gòu)。在本研究中，miR-124過表達可導致TGF-β1和p-Smad2的表達均顯著下調(diào)，這提示miR-124過表達可能通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路的激活從而改善右心重構(gòu)。但是，由于AAV-miR-124是通過氣管局部給藥，其在肺組織中的表達顯著增加，但在右心組織中的表達與其它3組相比無顯著差異。因此，肺組織中過表達的miR-124并非直接下調(diào)右心組織中TGF-β1和 p-Smad2的表達，而是可能通過降低肺動脈的壓力、減輕肺循環(huán)阻力，進而導致TGF-β1和p-Smad2的表達下調(diào)，從而減輕右心室心肌重構(gòu)。腺相關(guān)病毒是一種無致病性的人細小病毒，具有轉(zhuǎn)染效率高、免疫原性低、可感染多種細胞且能長期穩(wěn)定表達等優(yōu)點，是目前基因治療研究最為常用的載體[15-16]。在本研究中，miR-124在肺和右心組織中表達結(jié)果顯示，AAV-miR-124重組體通過氣道給藥后主要在肺組織中表達，表明AAV具有明顯的嗜肺性，這與Halbert等[17]的報道相一致。4組大鼠在死亡率上無顯著差異，但與MCT+NS組和MCT+GFP組相比，MCT+miR-124組大鼠有較低的死亡率，表明AAV介導的miR-124過表達有一定的安全性。

綜上所述，本研究通過AAV介導的miR-124的過表達的方法，可有效降低野百合堿誘導的右心室收縮壓、減輕右心重構(gòu)。本研究有望為肺動脈高壓和右心重構(gòu)的基因治療提供新的思路。