壓力超負(fù)荷致小鼠心肌肥厚中miR-378對(duì)熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1的調(diào)節(jié)作用

苑 潔，鄒云增

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所，上海 200032

心血管疾病是全球范圍內(nèi)危害人類健康的“頭號(hào)殺手”。心肌肥厚是許多心臟疾病如高血壓、心瓣膜病、充血性心力衰竭及先天性心臟病的代償反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致心力衰竭。而血流動(dòng)力學(xué)壓力超負(fù)荷是引起心肌肥厚進(jìn)而發(fā)生心力衰竭的主要因素。心臟在壓力負(fù)荷初期通常表現(xiàn)為代償性心肌肥厚，以滿足機(jī)體的各種生命活動(dòng)的需要。然而當(dāng)心臟在持續(xù)壓力超負(fù)荷情況下，代償性心肌肥厚會(huì)發(fā)展為失代償性心肌肥厚，從而誘發(fā)心功能不全和心力衰竭，增加猝死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。

熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)在許多病理?xiàng)l件的(缺血損傷、氧化應(yīng)激、壓力超負(fù)荷等)刺激下均可以對(duì)心臟起保護(hù)作用，并在適應(yīng)性的生理性心肌肥厚中發(fā)揮重要作用[1-5]。壓力超負(fù)荷下，HSF1能促進(jìn)心臟血管新生、抑制心肌纖維化、維持心肌重構(gòu)的早期代償[6-7]，然而有關(guān)其調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道甚少。因此，研究HSF1在心肌肥厚中的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于臨床治療中心功能的改善具有重要意義。

MicroRNA(簡稱miRNA)是廣泛存在于真核生物中長度約為21 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在生物體內(nèi)的生理及病理過程中都扮演著重要角色[8-10]。已有研究證實(shí)，很多miRNAs參與心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中重要基因的調(diào)控[9,11-12]。MiRNA是否也參與心臟保護(hù)因子HSF1的調(diào)控，值得進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 小鼠壓力超負(fù)荷模型(TAC)的建立 C57B/L6雄性小鼠，周齡為10～12周，體質(zhì)量18～22 g，購于上海中科院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠麻醉后臥于鼠板固定，氣管插管后連接呼吸機(jī)，沿胸骨左側(cè)的第二肋骨剪斷肋骨，在主動(dòng)脈凸側(cè)分支的第一和第二分支之間將絲線穿過主動(dòng)脈弓，用31G針頭造成升主動(dòng)脈環(huán)行縮窄，之后逐層縫合。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.2 小鼠心臟超聲和血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 對(duì)小鼠假手術(shù)組和TAC模型術(shù)后2周進(jìn)行心功能和動(dòng)脈收縮壓(ASP)測(cè)定。使用加拿大VisualSonics公司Vevo 770超聲診斷儀和30 MHz高頻探頭進(jìn)行小鼠的心臟超聲檢測(cè)心臟功能，記錄B-Mode圖像，測(cè)量左室舒張期前壁厚度(LVAWd)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)等指標(biāo)。使用Millar導(dǎo)管對(duì)小鼠ASP進(jìn)行測(cè)定。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取1～3 d SD大鼠乳鼠15只，購于上海中科院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。用75%乙醇消毒，取心尖大部用PBS洗2次，將組織剪碎。用0.1%胰酶溶液37℃消化5～6次，每次8 min，收集上清到DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中終止消化，1 200r/min 離心5 min，將細(xì)胞沉淀收集到1個(gè)裝有DMEM低糖標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的收集管中，將收集得到的細(xì)胞懸液加入2個(gè)10 mm培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行差速貼壁法分離。2 h后，吸取上清，按照1×106/mL將細(xì)胞接種，次日換液，加入新鮮的DMEM低糖培養(yǎng)基。

1.4 MiR-378模擬物或抑制物細(xì)胞轉(zhuǎn)染 心肌細(xì)胞貼壁24 h后，換成無血清無抗生素低糖培養(yǎng)基預(yù)處理過夜，使用轉(zhuǎn)染試劑siPORTTMNeoFXTMTransfection Agent(Fisher, AM4510)轉(zhuǎn)染miR-378 模擬物 (35 nmol/L) (Applied Biosystems，AM17100)或抑制物(50 nmol/L) (Applied Biosystems，AM17000)分子以及FAM標(biāo)記模擬物和抑制物的陰性對(duì)照。48 h后收集細(xì)胞或?qū)?xì)胞進(jìn)行機(jī)械牽張刺激。

1.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將擴(kuò)增得到的HSF1野生型基因3′UTR或突變型片段各自插入到pMIR-REPORTTMluciferase miRNA expression(Applied Biosystems，AM4510) 報(bào)告載體中得到Luc-HSF1及種子序列突變載體Luc-HSF1-MU，使用FuGENE HD(Roche，E2311)根據(jù)分組將熒光素酶報(bào)告載體和miR-378模擬物或抑制物共轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，48 h后使用Dual-Light○RSystem(Applied Biosystems，T1003)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光值。

1.6 miRNA表達(dá)水平檢測(cè) 用TRIzol試劑(InvitrogenTM，15596018)從心肌組織和心肌細(xì)胞中提取總RNA，并通過NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)量濃度。使用TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems，4427975)在ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，U6作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒操作。

1.7 Western 印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 心肌組織或心肌細(xì)胞用RIPA(碧云天，P0013C)裂解，混勻后4℃振蕩4 h，以12 000×g離心15 min(4℃)，上清為總蛋白質(zhì)。Western印跡按常規(guī)步驟電泳，每孔加入20～40 μg蛋白量，使用HSF1(CST，4356)、Hsp27(CST，95357)抗體和HRP偶聯(lián)的兔二抗(CST，7075)檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠心肌組織內(nèi)HSF1和miR-378的表達(dá)變化 小鼠心肌肥厚(圖1A)代償期時(shí)心肌HSF1表達(dá)顯著升高，而miR-378的表達(dá)顯著下降。血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：TAC術(shù)后小鼠的ASP、收縮壓、左心室舒張末期壓力、收縮末期壓力均明顯升高(P<0.05)，心肌肥厚處于代償期，心功能無顯著下降，LVEF值與假手術(shù)組相比無顯著差異(圖1B)。小鼠心臟超聲數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：TAC手術(shù)2周后心肌肥厚顯著，心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值HW/BW、左室壁厚度顯著增加(P<0.05，圖1C)。TAC小鼠手術(shù)2周后心肌內(nèi)HSF1及其下游調(diào)控蛋白Hsp27的表達(dá)均顯著升高(圖1D)，而心肌內(nèi)miR-378的表達(dá)顯著降低(圖1E)。

圖1 壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌肥厚小鼠心肌內(nèi)HSF1和miR-378的表達(dá)變化

A： 小鼠TAC 術(shù)后2周及假手術(shù)組心臟外觀、血流動(dòng)力學(xué)變化；B：小鼠TAC術(shù)后ASP和LVEF表達(dá)變化; C:小鼠TAC術(shù)后LVAWd和HW/BW表達(dá)變化;D:Western印跡檢測(cè)TAC 術(shù)后2周小鼠心肌內(nèi)HSF1和Hsp27蛋白表達(dá)變化; E: 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TAC術(shù)后2周小鼠心肌內(nèi)miR-378的表達(dá)變化.*P<0.05與假手術(shù)組相比；n=5

2.2 心肌細(xì)胞體外牽張刺激下HSF1和miR-378的表達(dá)變化 使用0.01%鼠尾膠原溶液按照6～10 μg/cm2的濃度包被硅膠皿，室溫下在無菌操作臺(tái)內(nèi)將硅膠皿風(fēng)干后。心肌細(xì)胞接種到硅膠皿培養(yǎng)后，將硅膠皿放在機(jī)械牽張板上拉伸，使得其長度可以增加20%。對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞機(jī)械牽張刺激12 h、24 h，檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)HSF1和miR-378的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)HSF1的蛋白表達(dá)水平在牽張24 h后顯著升高(P<0.05，圖2A)，miR-378的表達(dá)水平在機(jī)械牽張24 h后卻顯著下降(P<0.05，圖2B)。

圖2 心肌細(xì)胞體外牽張刺激下HSF1和miR-378的表達(dá)變化

2.3 MiR-378對(duì) HSF1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-378模擬物(Pre-miR-378)、miR-378抑制物(Anti-miR-378)及FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照組(mock)，24 h后分別在普通光鏡下和熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)90%以上的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%(圖3A)。轉(zhuǎn)染48 h后，Real-time PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染模擬物組心肌細(xì)胞中miR-378的表達(dá)量顯著升高，轉(zhuǎn)染抑制物組心肌細(xì)胞內(nèi)源miR-378的表達(dá)被顯著抑制(圖3B)。檢測(cè)HSF1蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-378模擬物組HSF1的表達(dá)被顯著抑制(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-378抑制物組HSF1表達(dá)顯著升高(P<0.05，圖3C)。心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-378能夠顯著抑制機(jī)械牽張引起的HSF1升高(圖3D)。

分析HSF1 3′UTR區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在第1743～1765個(gè)堿基區(qū)域內(nèi)有miR-378的潛在靶向結(jié)合種子序列(圖3E)。構(gòu)建包含HSF1 3′UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體Luc-HSF1及種子序列突變載體Luc-HSF1-MU，轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)miR-378時(shí)，轉(zhuǎn)染Luc-HSF1組細(xì)胞內(nèi)化學(xué)發(fā)光被顯著抑制，而Luc-HSF1-MU組則升高(P<0.05)；當(dāng)Cos7單獨(dú)轉(zhuǎn)染Luc-HSF1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)化學(xué)發(fā)光被顯著抑制，而當(dāng)抑制內(nèi)源miR-378時(shí)，化學(xué)發(fā)光的抑制作用被逆轉(zhuǎn)(P<0.05，圖3F)。因此，這些結(jié)果證實(shí)miR-378能夠通過靶向結(jié)合HSF1 3′UTR調(diào)控HSF1的表達(dá)。

圖3 MiR-378對(duì) HSF1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

A：心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的miR-378模擬物和抑制劑(陰性對(duì)照)，熒光普通光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%； B：轉(zhuǎn)染miR-378模擬物和抑制物后，miR-378在心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況； C：Western 印跡檢測(cè)心肌細(xì)胞過表達(dá)和抑制miR-378后HSF1的表達(dá)變化；D：Western 印跡檢測(cè)機(jī)械牽張刺激后心肌細(xì)胞內(nèi)HSF1的蛋白表達(dá)；E：miR-378在HSF1 3′UTR的靶向結(jié)合位點(diǎn)，以及HSF1 3′UTR種子序列的突變型；F：熒光素酶保護(hù)基因檢測(cè)示miR-378可直接靶向結(jié)合HSF1 3′UTR.*P<0.05,n=3

3 討 論

HSF1在多種病理?xiàng)l件刺激下，如缺血損傷、氧化應(yīng)激、壓力超負(fù)荷等，均對(duì)心臟起到一定的保護(hù)作用[3,6,13]。另外有研究證明，當(dāng)機(jī)體內(nèi)的HSF1表達(dá)降低時(shí)，心臟對(duì)外界刺激的適應(yīng)性會(huì)隨之降低[14]。這些均表明在代償性心肌肥厚反應(yīng)中，HSF1可能是一種生理性的保護(hù)因子，但是對(duì)于其引起這種保護(hù)性效應(yīng)的機(jī)制，目前研究還是十分有限。

在心肌損傷中，一些miRNA與HSF1之間的調(diào)節(jié)作用被報(bào)道。HSF1能夠激活miR-135b的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[15]；在心肌肥厚中，HSF1通過調(diào)節(jié)HSP70的表達(dá)促進(jìn)miR-23表達(dá)的升高[16]；在急性心梗的小鼠中，敲除內(nèi)源性HSF1會(huì)促進(jìn)miR-208的表達(dá)[17]；房顫發(fā)生后，通過調(diào)節(jié)HSF1可引起miR-432表達(dá)的升高[18]；miR-1可以上調(diào)HSF1的表達(dá)，當(dāng)miR-1表達(dá)下調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生[19]。本研究通過構(gòu)建心肌肥厚的代償模型，從在體和細(xì)胞水平同時(shí)觀察內(nèi)源性HSF1和miR-378的表達(dá)變化，并對(duì)其中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。

本研究中，TAC處理2周后，小鼠表現(xiàn)為代償期的病理性心肌肥厚，伴隨心肌內(nèi)源性HSF1及其下游調(diào)控蛋白Hsp27的代償性升高，而心肌內(nèi)源性miR-378的表達(dá)卻明顯下降。細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張刺激心肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性miR-378的表達(dá)下降，而HSF1的表達(dá)則會(huì)升高。之前的研究[1-5]認(rèn)為HSF1在適應(yīng)性心肌肥厚中發(fā)揮重要作用，在心肌肥厚的早期代償階段表現(xiàn)為代償性的表達(dá)升高。那么在心肌組織中，HSF1的代償性升高是否受到miR-378的調(diào)控？本研究在心肌細(xì)胞中分別過表達(dá)和抑制miR-378，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過表達(dá)miR-378時(shí)會(huì)抑制HSF1的表達(dá)，而抑制miR-378的表達(dá)會(huì)使內(nèi)源性HSF1的表達(dá)升高，并且在機(jī)械牽張刺激下，過表達(dá)miR-378會(huì)抑制HSF1的升高，證實(shí)了miR-378參與了HSF1的表達(dá)調(diào)控。利用生物信息學(xué)軟件miRanda和RNAhybrid分析miR-378的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)HSF1的3′UTR上有miR-378的靶向結(jié)合位點(diǎn)，且最小自由能為-28.4 kal/mol，說明其可以為miR-378的結(jié)合提供很好的空間結(jié)構(gòu)，本研究進(jìn)一步利用熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)了miR-378可以靶向結(jié)合HSF1 3′UTR，進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄后的翻譯。

綜上所述，HSF1作為心肌內(nèi)源重要的保護(hù)因子，在心肌缺血缺氧、機(jī)械應(yīng)力及炎癥損傷中均發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。在高血壓心肌肥厚的早期代償階段，心肌miR-378表達(dá)的下降使得其對(duì)內(nèi)源性HSF1轉(zhuǎn)錄后抑制作用減弱，進(jìn)而對(duì)HSF1的代償性升高發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。由于miRNA表達(dá)及調(diào)控的時(shí)序性的復(fù)雜性，有關(guān)miR-378通過調(diào)節(jié)HSF1在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展階段所發(fā)揮的生物學(xué)功能需要進(jìn)一步深入研究，同時(shí)miR-378與miR-1是否協(xié)同調(diào)節(jié)HSF1也需要深入探討。該研究對(duì)于HSF1參與調(diào)節(jié)心肌保護(hù)的機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)，為心肌重構(gòu)干預(yù)靶點(diǎn)的開發(fā)提供了新思路。