茶條槭組織培養(yǎng)防止外植體褐化的方法研究

楊蘭芳　黃桂云　張國禹　吳笛　張定軍

摘要? ? 為探索克服茶條槭在組培過程中外植體褐化的最佳方法，以茶條槭當年生萌條為試材， 進行了不同外植體類型、不同消毒方式、不同取材時間和不同抗褐化劑對茶條槭初代培養(yǎng)過程中外植體褐化的影響試驗。結(jié)果表明，采用當年生萌條進行組織培養(yǎng)，其莖段較莖尖褐化嚴重;先將外植體用1 000 mg/L VC溶液處理30 min，再用0.1%升汞溶液消毒為最佳消毒方法;外植體取材時間在5月，其組培污染率、褐變率、死亡率相對較低;在一定濃度范圍內(nèi)，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）200 mg/L與活性炭（AC）2 g/L配合使用防褐化效果較好;初代培養(yǎng)時，先弱光培養(yǎng)7 d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，有利于抑制褐變的發(fā)生。由此說明，選用幼嫩的頂芽為外植體、濃度0.1%升汞溶液為消毒劑、MS為基本培養(yǎng)基、添加聚乙烯吡咯烷酮200 mg/L和活性炭2 g/L進行初代培養(yǎng)，防止其褐化的效果最佳。

關(guān)鍵詞? ? 茶條槭;組織培養(yǎng);褐化;防止方法

中圖分類號? ? S722.3? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）15-0133-01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

茶條槭（Acer ginnala）為槭樹科槭樹屬落葉木樹種，廣泛分布于我國東北、內(nèi)蒙古、甘肅南區(qū)、華北及西北的陜西，常生于海拔400～1 200 m的陽坡灌叢或闊葉雜木林中，屬陽性樹種;喜溫暖，也耐寒;抗風雪，耐煙塵，較能適應(yīng)城市生態(tài)環(huán)境[1-2]。

以茶條槭的莖段及莖尖為外植體進行組織培養(yǎng)，探索通過器官發(fā)生途徑獲得再生植株，在初步誘導分化生長過程中，由于嚴重的褐化現(xiàn)象而抑制其生長分化，甚至導致其死亡[3-5]。本試驗主要針對這一關(guān)鍵時期進行抑制茶條槭組織褐變試驗，以篩選出較好的抑制褐化方法[6-7]。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試材料

供試材料為取自長江珍稀植物研究所種質(zhì)資源圃胸徑在8 cm左右的茶條槭當年生枝條。

1.2? ? 試驗設(shè)計

1.2.1? ? 不同外植體類型對外植體褐化的影響。以當年生萌條的頂芽和帶芽莖段為外植體開展初代試驗，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計其褐化情況。

1.2.2? ? 不同消毒方法對外植體褐化的影響。外植體消毒采用2種方式，分別為常規(guī)消毒和用1 000 mg/L VC消毒30 min+0.1%升汞消毒，研究消毒方法對外植體褐化的影響。

1.2.3? ? 不同取材時間對外植體褐化的影響。分別于4月下旬、5月上旬、6月上旬、7月下旬、9月上旬采集外植體，進行消毒處理后，接種于啟動培養(yǎng)基中。

1.2.4? ? 不同抗褐化劑對外植體褐化的影響。啟動培養(yǎng)基中添加不同濃度聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC），共設(shè)6個處理，分別為空白對照（CK）、AC 2 g/L（T1）、AC 4 g/L（T2）、PVP 100 mg/L（T3）、PVP 200 mg/L（T4）、AC 2 g/L+PVP 200 mg/L（T5），研究抗褐化劑對外植體褐化的影響。

1.2.5? ? 不同培養(yǎng)方式和光照條件對外植體褐化的影響。設(shè)光照培養(yǎng)、弱光培養(yǎng)和先弱光培養(yǎng)7 d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)3個處理，研究不同培養(yǎng)方式和光照條件對外植體褐化的影響，篩選較好的培養(yǎng)方式。

1.3? ? 試驗方法

基本培養(yǎng)基為MS，添加激素類物質(zhì)有6-BA、NAA、TDZ、GA3，附加瓊脂5 g/L、蔗糖30 g/L。先對茶條槭外植體進行消毒處理，然后將消毒好的外植體切段（長2 cm左右），再接種到培養(yǎng)基上。接種后置于（24±2）℃條件下光照培養(yǎng)，光照強度1 000 lx或2 500 lx，每天光照12 h。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不同外植體類型對外植體褐化的影響

采用當年生萌條的頂芽和帶芽莖段為外植體進行初代試驗，結(jié)果表明，帶芽莖段褐化率為20.35%，較頂芽褐化嚴重（表1）。

2.2? ? 不同消毒方法對外植體褐化的影響

由表2可知，常規(guī)消毒前采用濃度為1 000 mg/L的VC溶液浸泡30 min，其外植體培養(yǎng)過程中褐變程度最輕，且生長良好。

2.3? ? 不同取材時間對外植體褐化的影響

由表3可知，不同采集時間對外植體的污染率、褐變率和死亡率均有不同程度的影響。其中，4月下旬接種的外植體平均污染率最低（2.2%），褐變率為14.6%，死亡率為71.9%;5月采集的外植體平均污染率、褐變率、死亡率均相對較低，分別為4.5%、15.5%、24.5%;9月上旬采集的外植體污染率和褐變率較高。

2.4? ? 不同抗褐化劑對外植體褐化的影響

由表4可知，當PVP與AC同時使用時，抗褐化效果明顯，褐變率僅為19.4%，且對植物生長影響最小，外植體褐變少、長勢良好。

2.5? ? 光照條件及培養(yǎng)方式對外植體褐化的影響

試驗結(jié)果表明，開始階段適當?shù)娜豕馀囵B(yǎng)有助于減少褐化的產(chǎn)生或者減輕褐化的程度;但長時間的弱光培養(yǎng)會阻礙愈傷組織和不定芽的產(chǎn)生。在培養(yǎng)的起始階段，連續(xù)弱光培養(yǎng)7 d比較合適。

3? ? 結(jié)論與討論

在木本植物組織培養(yǎng)中，外植體的褐化是影響組培的主要原因之一。由于茶條槭含有較多的易氧化醌類物質(zhì)，褐化問題較為嚴重，因而防止褐化是茶條槭組織培養(yǎng)必須克服的難題。本試驗結(jié)果表明，采用當年生萌條進行組織培養(yǎng)，其莖段較莖尖褐化嚴重;先將外植體用1 000 mg/L VC溶液處理30 min，再用0.1%升汞溶液消毒為最佳消毒方法;5月采集外植體接種，茶條槭的污染率、褐變率、死亡率相對較低;聚乙烯吡咯烷酮（PVP）200 mg/L與活性炭（AC）2 g/L配合使用防褐化效果較好;初代培養(yǎng)時，先進行弱光培養(yǎng)7 d再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，有利于抑制褐變的發(fā)生。由此說明，選用幼嫩的頂芽為外植體、0.1%升汞溶液為消毒劑、MS為基本培養(yǎng)基、添加聚乙烯吡咯烷酮200 mg/L和活性炭2 g/L進行初代培養(yǎng)，防止其褐化的效果最佳。

4? ? 參考文獻

[1] 李巖巖.茶條槭（Acer ginnala）組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2007.

[2] 羅麗華.板栗組織培養(yǎng)及褐變研究[D].長沙：中南林學院，2004.

[3] 劉均利，馬明東.華蓋木組織培養(yǎng)中褐化控制研究[J].浙江林業(yè)科技，2007，27（1）：20-23.

[4] 李巖巖.茶條槭組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].山東林業(yè)科技，2010，40（2）：48-50.

[5] 孟月娥，周子發(fā)，李艷敏，等.茶條槭的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學通訊，2005（6）：790.

[6] 曹小勇.槭樹科槭屬植物形態(tài)學研究[J].漢中師范學院學報，2000（12）：69-72.

[7] 彭筱娜，易自力，蔣建雄，等.觀賞鳳梨組織培養(yǎng)中防止外植體褐化的初步研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2007（4）：67-69.